Farklı yumurta kanalı segmentleri farklı fizyolojik fonksiyonlara sahiptir ve patolojik değişime farklı olarak duyarlıdır. Çok küçük bir fare yumurta kanalındaki farklı segmentlerin tanımlanması, doku ayrışması ile iyi ayırt edilmiş hücrelerin iyi bir veriminin üretilmesi gibi zordur. Bu videoda, fare yumurtalığının nasıl çözüleceğini, farklı segmentlerin tek tek analiz edilebilmesi için nasıl tanınacağını ve son olarak, farklılaştırılmış ayrışmış hücrelerin nispeten yüksek veriminin nasıl üretileceğini göstereceğiz.
Ampullaya özgü ortamın daha iyi anlaşılması in vitro fertilizasyon tekniklerini geliştirebilir. Ayrıca, infundibulum'u diğer segmentlerle karşılaştırarak, infundibulumun kötü huylu dönüşüm eğilimini daha iyi anlayabiliriz. Tek hücreli ayrışma prosedürü stromal ve epitel hücrelerini yumurta kanalından kurtarır.
Yöntemimiz ayrıca bağışıklık, düz kas ve epitel hücre katkılarını fizyolojiye ve yumurta kanalı patolojisine ayrı ayrı analiz etme fırsatları sağlar. Diseksiyon mikroskobu altında çalışmak ilk başta zor olabilir. Aletlerinizin oviduct mikrodiseksiyon için yeterli olduğundan emin olmak için rahim gibi daha büyük bir tüple pratik yapmanızı tavsiye ederim.
Petri kabına yapışkanlı bir diş cilası parçası yapıştırarak ve kurumasını izin vererek başlayın. Daha sonra yemeği% 70 etanol ile sterilize edin. Yüzey artık diseksiyona hazır.
Diseksiyona hazır olduğunuzda, diş balmumunu içeren Petri kabını diseksiyon mikroskobu altında soğuk platformda hareketsiz hale getirin. Hayvanın ventral yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra steril diseksiyon makası ile karın ve pelvik boşluğu açın.
Dorsal bihornal uterusun yerini bulmak için gastrointestinal sistemi bir tarafa hareket ettinin. Böbreğin hemen altındaki rahim yağ yastığında zarflanmış her bir yumurtalığı ve yumurtalığı bulmak için her bir rahim boynuzu rostral olarak takip edin. Daha sonra hem yumurtalıklarla birlikte lateral oviducts hem de diseksiyon makası kullanılarak hala bağlı distal rahim boynuzu bir kısmını kesin.
Her bir lateral rahim boynuzu, hala sarmal yumurtalığa ve yumurtalığa bağlı olan boynuzun yaklaşık bir ila iki santimetresi ile kesin. Dokuyu hemen iki mililitre soğuk diseksiyon ortamına batırın, ardından diseksiyon için dokuyu sabitlemek için steril 25 kalibrelik bir iğne ile rahim dokusunu diş mumumuna yapıştırın. Yumurta kanalını net bir şekilde görselleştirmek için yumurtalık yağ yastığını ve bağ dokusunu temizleyin ve parçalara ayırın.
Bir ila iki damla steril% 1 toluidin mavi boya çözeltisi dağıtmak ve 30 saniye ila bir dakika boyunca kuluçkaya yatmak için bir mililitre şırınna kullanın. Soğuk DPBS ile durulayın ve ardından tüm sıvıyı çıkarın. Yumurtalığı sarmal yumurtalıktan hafifçe çekin.
Tubal dokudan ödün vermeden yumurtalığı yumurtalıktan çıkarmak için geniş bağdaki bursal zarı kesin. Rahim tubal kavşağına yanal bulunan yumurta kanalının distal fimbrial ucunu bulun. Tüpü yavaşça çekin ve yumurta kanalını aşamak için yaylı mikro makasla mezosalpinkste kesin.
Infundibular bölgeyi üretmek için tüpü kesin. Daha sonra ampullery bölgesini iki ve üç dönüş arasında keserek tüketime edin. Son olarak, kalan kısmı istimik bölge olan rahim tubal kavşağına kesin.
Parçalanmış doku segmentlerini sıvı nitrojene hemen dondurun ve ardından RNA izolasyonu için dokuya 200 mikrolitre soğuk RNA ekstraksiyon reaktifi ve bire bir homojenizasyon boncuk karışımı ekleyin. Fimbrial bölgeden başlayarak, tüpü yaylı makasla uzunlamasına kesin ve luminal epitelleri açığa çıkarmak için kaldıraç olarak epips kullanın. Yarık açık kısımları ve kalan yumurta kanalını yaklaşık bir ila iki milimetrelik parçalara ayırın.
Daha sonra dokuya beş mililitre sıcak enzimatik olmayan ayrışma tamponu ekleyin ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Occludin, nüklei ve asetilasyonlu tubulin için pozitif bir hücre kümesinin floresan ve faz kontrast görüntüleri burada gösterilmiştir. Kırmızı occludin, mavi çekirdekleri ve yeşil asetillenmiş tübulin anlamına geliyor.
Siliated apikal kenarlık protokol boyunca bozulmadan kalır ve tek hücrelere daha fazla sindirime dayanır. Bu temsili görüntülerde birleştirilmiş, kırmızı, mavi, faz kontrastı ve yeşil kanallar gösterilir. Kısa bir pronaz inkübasyonundan sonra, hücrelerin çoğunluğu tektir.
Propidium iyodür boyama Brightfield, kırmızı kanal PI pozitif ve birleştirmede yaklaşık% 93 canlılık gösterir. Birleştirmedeki içe, tek bir ayrışmış hücrede bozulmamış bir sınır gösterir. Bu tür hücreler aktif olarak cilia'yı dövüyor.
Tüm RNA mikrovolum spektrofotometre ve biyoanalyzer tarafından verim ve kalite için değerlendirildi. Sonuçlar, bu yöntemin, aşağı akış tahlilleri için uygun verim için iki hayvandan havuzlamanın gerekli olabileceği infundibular örnekler dışında segment başına 800 ila 1.200 nanogram RNA verdiğini göstermektedir. Infundibulum için sunulan sonuçlar, toplam dört infundibular bölgeden olmak üzere iki hayvandan toplanmaktadır.
Bu protokol, bir mikrovolum spektrofotometresi ve bir biyoanalyzer ile analiz edilen saf RNA'yı başarıyla elde eder. Örnekler, saf RNA nükleotid türlerinin tipik bir örneği olan 1,8 ila 2 arasında 260 ila 280 nanometre emilim oranına sahiptir. Numunelerin biyoanalizesi, aşağı akış ekspresyözü ve sıralama analizi için uygun olan yedinin üzerinde değerlendirilen RNA bütünlük sayısı ile yüksek RNA bütünlüğü gösterdi.
Tubal sistemi diseksiyon platformuna yapıştırmak için uterus boynuzundan bir ila iki santimetre tutmayı unutmayın. Ek olarak, toluidin mavi boyasının kullanımı, yumurta kanalının hızlı bir şekilde geri tepmesine yardımcı olur. Ne kadar hızlı geri tepme, koruma ve en az RNA bozulması o kadar iyi olur.
Bu yöntem, bireysel segment dizilimine izin vererek RNA dizilimi için uygun kalitede RNA elde etmek için yeterlidir. Hücre ayrışması, daha hassas bir segment ve hücre analizi sağlayan tek hücreli sıralama veya akış sitometrisi için uygundur. Yöntem, segment veya tek hücre düzeyindeki farklılıkları maskeleyen tüm tüp analizinin ötesine geçmesine yardımcı olacaktır.
