Diversi segmenti dell'ovidotto hanno funzioni fisiologiche distinte e sono differenzialmente suscettibili al cambiamento patologico. L'identificazione dei diversi segmenti in un ovidotto di topo molto piccolo è impegnativa, così come la produzione di una buona resa di cellule ben differenziate mediante dissociazione tissutale. In questo video, dimostreremo come srotolare l'ovidotto del topo, riconoscere i diversi segmenti in modo che possano essere analizzati individualmente e, infine, come produrre una resa relativamente alta di cellule dissociate differenziate.
Una migliore comprensione dell'ambiente specifico dell'ampolla può migliorare le tecniche di fecondazione in vitro. Inoltre, confrontando l'infundibulum con altri segmenti, possiamo comprendere meglio la propensione dell'infundibulum alla trasformazione maligna. La procedura di dissociazione a singola cellula libera le cellule stromali ed epiteliali dall'ovidotto.
Il nostro metodo offre anche l'opportunità di analizzare separatamente i contributi immunitari, muscolari lisci ed epiteliali alla fisiologia e alla patologia dell'ovidotto. Lavorare al microscopio di dissezione può essere difficile all'inizio. Consiglierei di esercitarsi con un tubo più grande come l'utero per garantire che i tuoi strumenti siano adeguati per la microdissezione dell'ovidotto.
Inizia apponendo un pezzo di cera dentale su una capsula di Petri con adesivo e lasciandolo asciugare. Quindi disinfettare il piatto con il 70% di etanolo. La superficie è ora pronta per la dissezione.
Immobilizzare la capsula di Petri contenente la cera dentale sulla piattaforma fredda sotto un microscopio di dissezione quando è pronta per la dissezione. Disinfettare la superficie ventrale dell'animale con il 70% di etanolo. Quindi aprire la cavità addominale e pelvica con forbici di dissezione sterili.
Spostare il tratto gastrointestinale su un lato per individuare l'utero bihornale dorsale. Seguire ogni corno uterino rostralmente per individuare ogni ovidotto e ovaio che sono avvolti nel cuscinetto di grasso uterino appena sotto il rene. Quindi asportare entrambi gli ovidotti laterali con le ovaie e una porzione del corno uterino distale ancora attaccato usando le forbici di dissezione.
Tagliare ogni corno uterino laterale con circa uno o due centimetri del corno ancora attaccato all'ovidotto e all'ovaio arrotolati. Immergere immediatamente il tessuto in due millilitri di mezzo di dissezione a freddo, quindi apporre il tessuto uterino alla cera dentale con un ago sterile da 25 gauge per fissare il tessuto per la dissezione. Pulire e sezionare il cuscinetto di grasso ovarico e il tessuto connettivo per visualizzare chiaramente l'ovidotto.
Utilizzare una siringa da un millilitro per erogare una o due gocce di soluzione sterile di colorante blu toluidina all'1% e incubare per 30 secondi a un minuto. Risciacquare con DPBS freddo e quindi rimuovere tutto il liquido. Tirare leggermente l'ovaio dall'ovidotto arrotolato.
Tagliare la membrana borsale nel legamento largo per rimuovere l'ovaio dall'ovidotto senza compromettere il tessuto tubarico. Individuare l'estremità fimbriale distale dell'ovidotto che si trova lateralmente alla giunzione tubarica uterina. Tirare delicatamente il tubo e tagliare via il mesosalpinx con micro-forbici a molla per srotolare l'ovidotto.
Tagliare il tubo per produrre la regione infundibolare. Quindi asportare la regione ampollare tagliando tra i giri due e tre. Infine, tagliare la porzione rimanente alla giunzione tubarica uterina che è la regione istmica.
Congelare immediatamente i segmenti di tessuto sezionati in azoto liquido e quindi aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA freddo e miscela di perline di omogeneizzazione one-to-one al tessuto per l'isolamento dell'RNA. Partendo dalla regione fibriale, tagliare longitudinalmente il tubo con forbici a molla e utilizzare la pinza come leva per esporre l'epitelio luminale. Tritare le porzioni aperte a fessura e l'ovidotto rimanente in segmenti di circa uno o due millimetri.
Quindi aggiungere cinque millilitri di tampone di dissociazione caldo non enzimatico al tessuto e incubare a 37 gradi Celsius. Qui vengono mostrate immagini fluorescenti e a contrasto di fase di un cluster cellulare positivo per occludina, nuclei e tubulina acetilata. Il rosso denota occludina, il blu denota nuclei e il verde denota tubulina acetilata.
Il bordo apicale ciliato rimane intatto per tutto il protocollo e resiste a un'ulteriore digestione alle singole cellule. In queste immagini rappresentative vengono mostrati i canali uniti, rosso, blu, contrasto di fase e verde. Dopo una breve incubazione della pronasi, la maggior parte delle cellule sono singole.
La colorazione dello ioduro di propidio mostra una vitalità di circa il 93% in Brightfield, pi positivo del canale rosso e fusione. L'inserto all'unione mostra un bordo ciliato intatto su una singola cella dissociata. Tali cellule hanno attivamente battendo le ciglia.
L'RNA intero è stato valutato per la resa e la qualità mediante spettrofotometro a microvolume e bioanalizzatore. I risultati mostrano che questo metodo produce da 800 a 1.200 nanogrammi di RNA per segmento, ad eccezione dei campioni infundibolari in cui può essere necessario il pooling di due animali per una resa appropriata per i saggi a valle. I risultati presentati per l'infundibulum sono raggruppati da due animali, per un totale di quattro regioni infundibolari.
Questo protocollo raggiunge con successo l'RNA puro analizzato con uno spettrofotometro a microvolume e un bioanalizzatore. I campioni hanno un rapporto di assorbimento di 260 per 280 nanometri tra 1,8 e 2, tipico delle specie di nucleotidi di RNA puro. La bioanalisi dei campioni ha mostrato un'elevata integrità dell'RNA con un numero di integrità dell'RNA valutato superiore a sette, appropriato per l'espressione a valle e l'analisi di sequenziamento.
Ricorda di trattenere uno o due centimetri del corno uterino per fissare il sistema tubarico alla piattaforma di dissezione. Inoltre, l'uso del colorante blu toluidina aiuta nello srotolamento rapido dell'ovidotto. Più veloce è lo srotolamento, migliore è la conservazione e la minima quantità di degradazione dell'RNA.
Questo metodo è sufficiente per ottenere RNA di qualità appropriata per il sequenziamento dell'RNA che consente il sequenziamento dei singoli segmenti. La dissociazione cellulare è appropriata per il sequenziamento a singola cellula o la citometria a flusso che consente un'analisi più precisa del segmento e della cellula. Il metodo aiuterà a spostare il campo oltre l'analisi dell'intero tubo che maschera le differenze a livello di segmento o singola cella.
