다른 oviduct 세그먼트는 뚜렷한 생리적 기능을 가지고 있으며 병리학적 변화에 차별화되기 쉽습니다. 매우 작은 마우스 oviduct에서 다른 세그먼트의 식별은 조직 해리에 의해 잘 분화 된 세포의 좋은 수율의 생산과 마찬가지로 도전적이다. 이 비디오에서는 마우스 배관을 풀고, 서로 다른 세그먼트를 인식하여 개별적으로 분석할 수 있도록 하는 방법을 시연하고, 마지막으로 분화된 분리된 세포의 비교적 높은 수율을 생성하는 방법을 시연할 것입니다.
암풀라에 특화 된 환경의 더 나은 이해체 외 수정 기술을 향상 시킬 수 있습니다. 또한, 다른 세그먼트와 fundibulum을 대조적으로, 우리는 더 나은 악성 변화에 대한 fundibulum의 성향을 이해할 수 있습니다. 단세포 해리 절차는 기질뿐만 아니라 난소로부터상피 세포를 해방시다.
우리의 방법은 또한 별도로 면역, 부드러운 근육, 그리고 난소의 생리학 및 병리에 상피 세포 기여를 분석하는 기회를 제공합니다. 해부 현미경하에서 일하는 것은 처음에 어려울 수 있습니다. 난 당신의 도구가 oviduct 미세 절에 적합한지 확인하기 위해 자궁과 같은 더 큰 튜브로 연습하는 것이 좋습니다.
먼저 치과 용 왁스를 접착제로 페트리 접시에 부착하고 건조하게하십시오. 그런 다음 70 %의 에탄올로 요리를 소독합니다. 이제 서피스가 해부할 준비가 되었습니다.
해부를 준비하면 해부 현미경으로 차가운 플랫폼에 치과 왁스가 들어있는 페트리 접시를 고정하십시오. 동물의 복부 표면을 70%에탄올로 소독합니다. 그런 다음 멸균 해부 가위로 복부와 골반 구멍을 엽니다.
위장관을 한쪽으로 이동하여 등쪽 양혼 자궁을 찾습니다. 각 자궁 뿔을 따라 신장 바로 아래 자궁 지방 패드에 둘러싸인 각 oviduct 및 난소를 찾습니다. 그런 다음 난소와 해부 가위를 사용하여 여전히 부착 된 해회 자궁 뿔의 일부를 가진 측면 배반소를 모두 소비합니다.
각 측면 자궁 경적을 코일 난기와 난소에 부착된 뿔의 약 1~2센티미터로 자릅니다. 차가운 해부 매체의 2 밀리리터에 즉시 조직을 담급하고, 멸균 25 게이지 바늘로 치과 왁스에 자궁 조직을 부착하여 해부를 위한 조직을 확보합니다. 난소 지방 패드와 결합 조직을 깨끗하고 해부하여 oviduct를 명확하게 시각화합니다.
1 밀리리터 주사기를 사용하여 멸균 1%의 토루이딘 블루 염료 용액을 1~2방울 에 분배하고 30초에서 1분 동안 배양합니다. 차가운 DPBS로 헹구고 모든 액체를 제거합니다. 코일 난소에서 난소를 가볍게 당깁니다.
관 조직을 손상시키지 않고 oviduct에서 난소를 제거하기 위해 넓은 인대의 활액 막에서 잘라. 자궁 관 접합에 측면 발견 oviduct의 탈경 피모브리알 끝을 찾습니다. 튜브를 부드럽게 당기고 스프링폼 마이크로 가위로 메소살핀스를 잘라 내어 배관을 풀어냅니다.
튜브를 잘라 내어 기금이 없는 영역을 생성합니다. 그런 다음 2턴과 3회전 사이를 절단하여 암풀 영역을 소비합니다. 마지막으로, 나머지 부분을 자궁 관 접합부로 잘라내어 isthmic 영역입니다.
즉시 액체 질소에서 해부 된 조직 세그먼트를 동결 한 다음 RNA 절연을위한 조직에 감기 RNA 추출 시약 및 일대일 균질화 비드 믹스의 200 마이크로 리터를 추가합니다. fimbrial 영역에서 시작하여 스프링 폼 가위로 튜브를 세로로 슬릿하고 포셉을 레버리지로 사용하여 발광 상피를 노출시합니다. 슬릿 열린 부분과 나머지 oviduct를 약 1~ 2밀리미터 세그먼트로 다진다.
그런 다음 조직에 따뜻한 비 효소 해리 버퍼의 5 밀리리터를 추가하고 섭씨 37도에서 배양합니다. 폐백, 핵 및 아세틸화 튜룰린에 대해 양성 세포 클러스터의 형광 및 위상 대조 이미지가 여기에 나와 있다. 빨간색은 폐골, 파란색을 나타내며 녹색은 아세틸화된 튜룰린을 나타냅니다.
섬광 식 테두리는 프로토콜 전체에 걸쳐 그대로 유지되며 단일 세포에 대한 추가 소화를 견딜 수 있습니다. 이러한 대표적인 이미지에서 병합, 빨간색, 파란색, 위상 대비 및 녹색 채널이 표시됩니다. 짧은 pronase 인큐베이션 후, 세포의 대부분은 단일.
프로피듐 요오드 스테인닝은 브라이트필드에서 약 93%의 생존력을 나타내며, 적색 채널 PI 양성 및 병합을 나타낸다. 병합시 인셋은 단일 해리 셀에 그대로 섬모테두리를 표시합니다. 이러한 세포는 적극적으로 섬모를 치고있다.
전체 RNA는 마이크로볼륨 분광광광계 및 생체 분석기별 수율 과 품질평가를 받았습니다. 결과는 이 방법이 다운스트림 에세이에 적합한 수율에 필요할 수 있는 2개의 동물에게서 풀링이 필요할 수 있는 기금 식 견본을 제외하고 세그먼트 당 800 내지 1, 200 나노그램 RNA를 산출한다는 것을 보여줍니다. 기금 에 대한 제시 된 결과는 총 4 개의 기금 이성 지역인 두 마리의 동물로 구성됩니다.
이 프로토콜은 마이크로볼륨 분광광계 및 생체 분석기로 분석된 순수 RNA를 성공적으로 달성합니다. 시료는 순수 RNA 뉴클레오티드 종의 전형적인 1.8과 2 사이의 260~ 280 나노미터 흡수비를 갖는다. 시료를 생체 분석한 결과, 다운스트림 발현 및 시퀀싱 분석에 적합한 7개 이상의 평가된 RNA 무결성 수로 높은 RNA 무결성을 보였다.
관 시스템을 해부 플랫폼에 부착하기 위해 자궁 뿔의 1~2cm를 유지해야합니다. 또한, toluidine 블루 염료의 사용은 oviduct의 빠른 코일링에 도움이됩니다. 코일링이 빨라지고 보존이 향상되고 RNA 의 양이 적어집니다.
이 방법은 개별 세그먼트 시퀀싱을 허용하는 RNA 염기서열에 적합한 품질의 RNA를 얻기에 충분하다. 세포 해리는 보다 정확한 세그먼트 및 세포 분석을 허용하는 단세포 시퀀싱 또는 유동 세포측정에 적합합니다. 이 방법은 세그먼트 또는 단일 셀 수준에서 차이를 마스크 전체 튜브 분석을 넘어 필드를 이동하는 데 도움이됩니다.
