Hi.In 本视频，您将学习如何对灌注的小鼠心脏进行超极化MR研究。David Shaul是实验室的MD / PhD学生，将指导您完成各种技术和程序。今天，我们学习了一种研究超极化碳-13丙酮酸代谢的方案，并结合了31P NMR波谱。
丙酮酸代谢处于有氧和厌氧代谢的十字路口。因此，它对于研究心脏的各种状况具有重要价值。所以，让我们开始吧。
分离小鼠心脏并灌注Krebs-Hensleit缓冲液，在10毫米NMR管内。然后将心脏插入核磁共振波谱仪。在那里，通过观察三磷酸腺苷、磷酸肌酸和无机磷酸盐的共振，记录 31P 光谱以观察心脏能量和 pH 值。
同时，在第一个位置用碳-13标记的丙酮酸样品是超极化的。溶解发生后，将其注射到心脏以允许实时测量乳酸，无机物和丙酮酸有组织的活动。实验前一天，准备400毫升改良的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液。
作为第一步，我们在双蒸水中解决这些成分。然后，用这种氧气混合物将该溶液搅拌20分钟，然后加入氯化钙。将pH值调节至7.4。
在实验当天，加入葡萄糖和胰岛素。将水浴设置为 40 摄氏度。将装有200毫升KH缓冲液的培养基瓶插入浴中。
使用蠕动泵回收KH缓冲液。连接到它，一条流入线和两条流出线。将流入和流出管线插入加热的KH缓冲液中。
使用含有 95% O2 和 5% CO2 的氧气混合器。然后，将氧气管插入加热的KH缓冲液中。打开蠕动泵并将其调节到每分钟 7.5 毫升的恒定流量重量。
我们想在引入心脏之前校准系统。因此，将流入和流出管线插入10毫米NMR管，并插入与NMR兼容的光学温度探头。将 NMR 管插入磁孔。
将加热罐调节到42摄氏度，并使用NMR加热将磁铁内部的温度调节到37摄氏度。请注意，NMR温度实际上是使用NMR兼容温度核心在磁体内部的KH缓冲器中进行监测的。现在，我们可以使用31P光谱来观察缓冲液内无机磷酸盐的信号。
这是外科手术所需的设备。将100毫升KH缓冲液放入冰中，并用相同的氧气混合物将其鼓泡。用3.3%异氟醚与室内空气混合进行诱导，以每分钟340毫升的流速麻醉箱腔内的小鼠。
将鼠标转移到鼻麻醉中。在相同的流速下还原至2.9%异氟醚。捏住脚以验证负踏板疼痛反射，并且鼠标已完全麻醉。
腹膜内向小鼠注射300单位肝素钠。将皮肤切开剑突下方两厘米处。切开腹壁，露出腹腔。
将剪刀夹放在剑突和胸部皮肤之间，并用它来缩回胸壁并露出横膈膜。刺穿隔膜的右叶，然后切割隔膜的其余部分。穿过胸壁中线，同时避免接触心脏和血管等更深的器官。
向心脏左心室注射200单位肝素钠。向心脏注射0.1毫升0.5摩尔KCL，以达到心脏骤停。将胸腺组织向前缩回，并将其从根部切开，露出其下方的主动脉。
尝试尽可能多地去除胸腺组织，同时避免损坏主动脉。去除残留的胸腔组织，让静脉导管自由通过。将弯曲的镊子放在主动脉下方，并用它来在主动脉周围放置丝线结。
将弯曲的镊子放在主动脉根部，并将心脏向下缩回以暴露和拉伸主动脉。向左心室注射三毫升冰冷的KH缓冲液，以清除主动脉中的血凝块并保持心脏活力。在心脏表面也滴几滴。
使用静脉导管针刺穿主动脉壁，而不损伤后壁。然后，用针头插入导管，约三毫米。之后，取下针头并同时插入导管再插入五毫米，但避免进入左心室。
将氰基丙烯酸酯粘合剂放在主动脉的穿刺区域，以防止导管在收紧缝合线时从导管滑出主动脉。轻轻地在主动脉和插管之间打一个结。向左心室再注射5毫升KH缓冲液，并验证其是否流过插管。
这标志着插管成功。从主动脉根部取出弯曲的镊子。断开心脏与周围内脏的连接，同时避免与插管剂和心脏组织接触。
立即将套管连接到流动的冰冷KH缓冲注射器。避免将气泡引入心脏很重要。切除非心脏组织。
在这个阶段，你应该观察心脏恢复跳动。剪断剩余的真丝缝合线边缘。在核磁共振室中，断开套管与注射器的连接，并将其连接到灌注系统的37 KH缓冲液。
然后，将心脏插入 10 毫米 NMR 管。将心脏放在探头的中心，然后将带有心脏的NMR管插入NMR波谱仪的孔中。执行垫片"使用 1H 通道上的水信号，直到线宽达到 10 到 20 赫兹。
然后，在稳态下使用50度的翻转角和1.1秒的TR来获取心脏的31P光谱。这些条件有利于ATP的信号，而不是PCr和无机磷酸盐的信号。观察ATP和PCr的信号，意味着组织在NMR波谱仪内是可行的。
使用专用的处理程序来分析光谱。执行 7 赫兹的指数上调。使用基线校正，然后将磷酸肌酸信号分配给负 2.5 ppm。
观察无机磷酸盐、磷酸肌酸和 ATP 的信号。极化丙酮酸样品，用碳13标记在第一个位置，持续80分钟。极化80分钟后，样品即可获得溶液。
这就是解散发生的方式。使用连续灌注方法将溶出内容物注入心脏。这种方法旨在输送丙酮酸而不会中断组织灌注和氧合水平。
将含有超极化丙酮酸的溶液介质注入锥形管中，然后手动注入旁路，然后，我们将灌注引导通过旁路，旁路内容物连续流过心脏，最终被洗掉。我们使用每分钟7.5毫升的灌注速率和22毫升的旁路体积。因此，超极化介质流经心脏大约三分钟。
在这个时间窗口中，我们使用碳13光谱来测量丙酮酸，乳酸和碳酸氢盐信号。我们使用在乳酸激发和碳酸氢盐激发之间交替的激发方案，间隔为六秒。我们使用饱和选择性激发来获取碳13信号。
在这种方法中，底物丙酮酸被最小激发，而代谢物乳酸和碳酸氢盐被完全激发。观察并记录碳13丙酮酸代谢约三分钟。丙酮酸信号衰减后代谢研究完成。
该图显示了从灌注有KH缓冲液的小鼠心脏记录的31P谱图。从心脏获得的光谱显示了α，β和γATP，PCr和Pi的信号.Pi信号由两个主要成分组成，左边的成分出现在较高的视场中，代表Pi信号，主要是由于pH值为7.4的KH缓冲液。右侧的边界和不太均匀的分量位于较低的场中，显示了处于更酸性环境中的 Pi 信号。
该成分起源于心脏组织。接下来，通过从整个Pi信号中减去缓冲器Pi信号来获得组织的Pi信号。然后将其从ppm标度转换为pH标度。
通过计算加权平均值、加权中位数、全局最大值和偏度，对组织 Pi 信号进行多参数分析来研究 pH 值。该图显示了在超极化碳13丙酮酸注射到灌注的小鼠心脏期间，使用超极化产物选择性饱和激发方法获得的典型碳13 NMR谱图。注意乳酸丙酮酸和碳酸氢盐信号。
丙酮酸信号在这里被截断以用于显示目的。底物和代谢物的信号强度的变化是由于T1弛豫，激发频率和流动特性。接下来，绘制这些信号的积分强度。
此外，我们使用32秒的有效衰变时间常数绘制了黑色圆圈，为T1衰变和4D频率激励的影响收集的丙酮酸积分强度。发现这种校正可以产生基板的预期流动动力学。冲洗、平台和冲洗。
使用这个校正的信号时间过程，我们选择了以浅蓝色突出显示的时间窗口进行进一步分析，其中NMR管中的丙酮酸浓度是恒定且最大。计算每个选定时间点的LDH和PDH速率，然后取平均值。该注射的主要值以每秒纳摩尔为单位提供。
总之，我们已经展示了在灌注的小鼠心脏中进行超极化丙酮酸代谢研究的实验系统。我们希望这一信息是有用的。
