马萨霉素的合成，一种革兰氏阳性细菌生长的小分子抑制剂

马萨里霉素是为数不多的阻止细菌细胞生长的细菌自身溶解素抑制剂之一。它可用于研究自身溶酶的化学和遗传失活之间的差异，并为研究细菌生理学的遗传学提供了一种正交的方法。马萨霉素的合成可能看起来令人生畏。

请严格按照所示步骤操作。当怀疑反应步骤是否有效时，通过薄层色谱法确认RF值的变化。首先，在甲醇中制备0.1摩尔环己胺，环己基甲醛，邻碘苯甲酸和环己基异腈溶液。

加入磁力搅拌棒，然后将五毫升环己胺和五毫升环己基甲醛混合在带盖的圆底烧瓶中，并将烧瓶置于热板搅拌器上的沙浴中，在40摄氏度下30分钟。使用放置在沙子表面以下约一厘米的温度计监测温度。30分钟后，向溶液中加入五毫升环己基异氰化物，并在50摄氏度下再搅拌20分钟。

然后，向反应混合物中加入五毫升邻碘苯甲酸，并继续在55摄氏度下搅拌三至五小时。搅拌三小时后，通过薄层色谱法或TLC以大约一小时的间隔定期监测反应的进展。当TLC板上只有一个保留因子等于0.3的点可见时，考虑反应完成。

减压除去旋转蒸发器中的溶剂。一旦所有甲醇蒸发，将干燥的粗产品溶解在30毫升乙酸乙酯中，并将其转移到分液漏斗中。依次用单摩尔盐酸、水、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液依次提取乙酸乙酯，每次提取时丢弃水层。

然后，从分液漏斗中取出乙酸乙酯层并将其收集在锥形瓶中。加入充满无水硫酸钠的刮刀，以除去乙酸乙酯中的残留水分。通过一号滤纸过滤干燥的乙酸乙酯溶液，以除去硫酸钠。

然后，用少量乙酸乙酯清洗滤纸。过滤后的乙酸乙酯溶液在减压旋转蒸发器上蒸发至干，一旦除去所有乙酸乙酯，即得油状马萨利霉素。将马萨霉素油溶解在一至两毫升的9：1己烷中至异丙醇溶液中，并在磁力搅拌板上搅拌，直到整个化合物溶解。

为了纯化溶解的马沙霉素，使用12克正相二氧化硅闪光柱进行快速色谱。用10列体积的流动相平衡闪蒸柱，仪器以每分钟15毫升的流速设置。平衡完成后，使用五毫升注射器抽取溶解的马沙霉素。

将注射器直接连接到平衡的闪蒸柱的顶部，并将溶液注入塔中。将上样柱重新连接到闪光色谱系统并启动梯度洗脱。从色谱柱中洗脱马沙霉素，使用梯度洗脱至最终流动相浓度为10∶90的己烷至异丙醇超过12柱体积。

通过吸收监测马萨利霉素在230和254纳米的洗脱。对于形态学研究，在37摄氏度的LB琼脂平板上生长枯草芽孢杆菌11774。在所有后续实验中，使用在五毫升LB肉汤中生长的第二代细胞，直到600纳米处的光密度达到1。

接下来，使用移液管，将马沙霉素加入到标记处理的培养管中，最终浓度为3.8微摩尔。对于标记的培养管对照，添加等量的DMSO。将样品置于37摄氏度的培养箱中90分钟，并以150 RPM振荡。

90分钟后，将培养物化学固定在培养基和固定缓冲液的1：10混合物中，在4摄氏度下过夜。第二天，使用移液器将10至20微升化学固定样品施加到玻璃显微镜载玻片上，并使其风干。然后，通过使用本生燃烧器加热载玻片来热固定风干样品。

热固后，用100微升0.1%亚甲基蓝染色样品。与污渍一起孵育10分钟后，用蒸馏水洗去多余的染料。然后，在烤箱中轻轻加热染色载玻片至60摄氏度15至20分钟，将细胞带到共同的焦平面。

通过在染色细胞上放置显微镜盖玻片来密封染色的样品。然后，使用显微镜载玻片水泥密封边缘。将密封的显微镜载玻片放在显微镜载物台上，并使用明场显微镜以100倍放大倍率将图像聚焦。

在显微镜载玻片上滴一滴浸油，并使用1000X放大倍率将视场聚焦。使用连接到显微镜及其相关软件的相机获取显微照片。使用软件的自动白平衡和光圈设置采集图像。

快速色谱法可以快速纯化高纯度的马萨霉素。本文介绍了肺炎链球菌中与 ATP 酶抑制剂 optochin 的协同作用或拮抗作用的评估。抑制细菌生长的化合物的最低浓度，以蓝色表示，被认为是在存在共药的情况下的最小抑制浓度值。

相反，粉红色的孔表示细菌生长。使用马沙霉素的表型测定是最低抑制浓度的0.75倍，显示枯草芽孢杆菌具有香肠样表型，肺炎链球菌具有结块表型。注意反应的温度。

通过TLC监测确保反应完成。该方法可以与荧光标记的抗生素结合使用，通过显微镜检查细胞壁的变化。