Масаримицин является одним из немногих ингибиторов бактериальных аутолизинов, который останавливает рост бактериальных клеток. Он может быть использован для исследования различий между химической и генетической инактивацией аутолизинов и обеспечивает ортогональный подход к генетике для изучения бактериальной физиологии. Синтез масаримицина может показаться пугающим.
Внимательно следуйте приведенным шагам. Если вы сомневаетесь, сработала ли стадия реакции, подтвердите с помощью тонкослойной хроматографии и изменения значений РЧ. Для начала приготовьте 0,1-молярный раствор циклогексиламина, циклогексилкарбоксальдегида, орто-йодбензойной кислоты и циклогексилизоцианида в метаноле.
Добавьте магнитный перемешивание, затем смешайте пять миллилитров циклогексиламина и пять миллилитров циклогексилкарбоксальдегида в колбе с круглым дном и поместите колбу в песчаную ванну на мешалку на конфорке на 30 минут при температуре 40 градусов Цельсия. Контролируйте температуру с помощью термометра, расположенного примерно на один сантиметр ниже поверхности песка. Через 30 минут добавьте в раствор пять миллилитров циклогексилизоцианида и перемешивайте еще 20 минут при 50 градусах Цельсия.
Затем добавьте пять миллилитров орто-йодбензойной кислоты в реакционную смесь и продолжайте перемешивание при 55 градусах Цельсия в течение трех-пяти часов. После трех часов перемешивания периодически контролируют ход реакции с помощью тонкослойной хроматографии, или TLC, с интервалом примерно в один час. Считать реакцию завершенной, когда на пластине TLC видно только одно пятно с коэффициентом удержания, равным 0,3.
Удалите растворитель во вращающемся испарителе при пониженном давлении. Как только весь метанол испарится, растворите высушенный сырой продукт в 30 миллилитрах этилацетата и перенесите его в сепараторную воронку. Экстрагируют этилацетат последовательно с помощью одномолярной соляной кислоты, воды, насыщенного раствора бикарбоната натрия, снова воды и насыщенного раствора хлорида натрия, отбрасывая водные слои при каждой экстракции.
Затем удалите слой этилацетата из сепараторной воронки и соберите его в колбу Эрленмейера. Добавьте шпатель, полный безводного сульфата натрия, чтобы удалить остаточную воду из этилацетата. Процедите высушенный раствор этилацетата через фильтровальную бумагу номер один, чтобы удалить сульфат натрия.
Затем промыть фильтровальную бумагу небольшим количеством этилацетата. Отфильтрованный раствор этилацетата выпаривали до сухости на ротационном испарителе при пониженном давлении для получения масаримицина в виде масла после удаления всего этилацетата. Растворите масло масаримицина в одном-двух миллилитрах гексана 9:1 до раствора изопропанола и перемешайте на магнитной пластине перемешивания до тех пор, пока все соединение не растворится.
Чтобы очистить растворенный масаримицин, выполните флэш-хроматографию с 12-граммовой, нормальнофазной, кремнеземной вспышкой колонки. Уравновешивайте столбец вспышки 10 колоннами объемов подвижной фазы с помощью приборов, установленных со скоростью потока 15 миллилитров в минуту. После того, как уравновешивание будет завершено, нарисуйте растворенный масаримицин с помощью пятимиллилитрового шприца.
Подключите шприц непосредственно к верхней части уравновешенной колонки вспышки и введите раствор в колонну. Повторно подключите загруженный столбец к системе флэш-хроматографии и инициируйте градиентное элюирование. Элют масаримицин из колонки с использованием градиентного элюирования до конечной концентрации подвижной фазы 10:90 гексана до изопропанола на 12 колонных объемах.
Контролировать элюирование масаримицина путем абсорбции на 230 и 254 нанометрах. Для изучения морфологии вырастите bacillus subtilis 11774 на пластинах агара LB при 37 градусах Цельсия. Во всех последующих экспериментах используют клетки второго прохода, выращенные в пяти миллилитрах бульона LB до тех пор, пока оптическая плотность в 600 нанометров не достигнет 1.
Далее, используя пипетку, добавляют масаримицин в культуральные пробирки, помеченные обработанной до конечной концентрации 3,8 мкмоль. Для культуральных трубок, помеченных контрольной маркировкой, добавьте эквивалентный объем ДМСО. Поместите образцы в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на 90 минут с встряхиванием при 150 оборотах в минуту.
Через 90 минут химически зафиксируйте культуры в смеси питательных сред 1:10 и зафиксируйте буфер при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день используйте пипетку, чтобы нанести от 10 до 20 микролитров химически закрепленных образцов на предметные стекла микроскопа и дать им высохнуть на воздухе. Затем нагрейте высушенные на воздухе образцы, нагревая стеклянные слайды с помощью горелки Бунзена.
После термофиксации окрашивают образцы 100 микролитрами 0,1% метиленового синего. После 10-минутной инкубации с пятном смойте излишки красителя дистиллированной водой. Затем осторожно нагрейте окрашенные слайды до 60 градусов Цельсия в духовке в течение 15-20 минут, чтобы вывести клетки в общую фокальную плоскость.
Запечатайте окрашенные образцы, поместив крышку микроскопа поверх окрашенных клеток. Затем запечатайте края с помощью цемента микроскопа. Поместите запечатанный слайд микроскопа на ступень микроскопа и поместите изображение в фокус при 100-кратном увеличении с помощью микроскопии яркого поля.
Поместите каплю погружного масла на предметное стекло микроскопа и сфокусируйте поле зрения с помощью увеличения 1000X. Получайте микроснимки с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу, и связанного с ним программного обеспечения. Получайте изображения с помощью автоматического баланса белого и настроек диафрагмы.
Флэш-хроматография позволяет быстро очистить масаримицин с высокой чистотой. Оценка синергизма или антагонизма с ингибитором АТФазы оптохином в S.pneumoniae представлена здесь. Самой низкой концентрацией соединения для ингибирования роста бактерий, обозначенной синим цветом, считается минимальное значение ингибирующей концентрации в присутствии со-препарата.
Напротив, колодцы розового цвета указывают на рост бактерий. Фенотипические анализы с использованием масаримицина в 0,75 раза превышают минимальные ингибирующие концентрации, продемонстрировали колбасоподобный фенотип для B.subtilis и слипающийся фенотип для S.pneumoniae. Обратите внимание на температуру реакции.
Убедитесь, что реакция завершена, путем мониторинга с помощью TLC. Этот метод может быть использован в сочетании с флуоресцентно мечеными антибиотиками для исследования изменений клеточной стенки с помощью микроскопии.
