用核磁共振波谱探索精氨酸甲基组

该协议可以量化精氨酸甲基化的水平和动力学。这种修饰起着重要的调节作用，可以作为疾病的生物标志物。这种方法的优点是，它为几乎无限数量的基质提供了简单的工作流程，从细胞、培养基到组织和生物流体。

精氨酸甲基化在许多人类癌症中升高，精氨酸方法转移酶的第一个抑制剂在临床试验中进行测试。这种方法可以帮助患者分层和风险评估。演示该程序的将是我实验室的研究技术人员Hansjorg Habisch。

对于液体样品，将400微升冰冷的甲醇加入200微升样品中，然后在零下20摄氏度孵育30分钟。将此样品在 10， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 30 分钟。移动上清液并将沉淀收集在1.5毫升管中。

对于固体材料，将 600 微升 66% 甲醇水加入含有 30 至 60 毫克组织或细胞沉淀的制浆管中。将软组织均匀化一次，持续 20 秒，将硬组织均匀化两次，持续 20 秒，中间间隔 5 分钟。立即将样品放在冰上，并将所有裂解物转移到新的1.5毫升管中，然后孵育。

然后，将样品以10， 000 G离心30分钟。在四摄氏度下，选择1.5毫升管中的上清液，并使用该上清液进行蛋白质水解。截断每个管子的盖子。

然后向每个样品中加入500微升9摩尔盐酸。最后，将管子放入玻璃管中。用盖子紧紧关闭它们，确保正确密封，并将这些管子放入部分装满沙子的玻璃烧杯中。

在干燥室中将样品在110摄氏度下水解16小时。冷却样品并使用高真空离心机冻干过夜。第二天，将完全干燥的颗粒溶解在一毫升0.1摩尔盐酸中。

向每个管中加入50微升氯仿，并使用1， 000微升移液管彻底溶解沉淀。将整个体积转移到新管中，并将样品离心10分钟。小心地将双相液体的上相收集在新管中。

使用塑料管进行手动或玻璃管进行机器人固相萃取。对于手动固相萃取，在每次运行中对滤芯进行预处理，然后离心一分钟。之后，将样品加载到SPE柱上，并在室温下以600 G离心两分钟。

用一毫升水清洗墨盒三次，每次洗涤后离心一分钟。然后用一毫升0.1摩尔盐酸洗涤五次，然后在室温下以800G离心一分钟。用一毫升甲醇清洗滤芯两次，然后离心一分钟。

加入一毫升三个X替代溶液并离心两次，将精氨酸及其衍生物洗脱到单个15毫升管中，持续一分钟。对于机器人固相萃取，将用于收集洗脱液的管和含有双相液体上相的玻璃管放入机器人的相应位置。根据手动 SPE 描述的步骤在软件中使用应用程序或方法。

将样品冻干过夜以完全干燥以去除氨和水。将每个样品溶解在500微升NMR缓冲液中，直到其变得均匀。然后将等量的均匀样品转移到每个NMR管中。

此处显示了使用SPE方案纯化的酵母蛋白水解产物的J-RES光谱。不同的特征化学位移可以区分 l-精氨酸和 ADMA 在百万分之 3.25 和 3.02.这两种物质都可以在细胞基质中分离和定量。

根据特定甲基或亚甲基在相应化学位移下的质子数，一个H核磁共振波谱可以精确定量。使用这种方法，SDMA和MMA的One H核磁共振化学位移可以通过百万分之2.76SDMA和百万分之2.74MMA的特征化学位移进行分离和量化。执行此协议时，用移液管小心地收集含有水溶性级分的双相液体的上相，并将其转移到新管中。

使用1.5毫升管进行手动SPE，或使用玻璃用于机器人SPE。避免溢出氯仿及其内容物。使用核磁共振波谱分析含有精氨酸和甲基化精氨酸的洗脱液。

这产生了这些物种的绝对数量。我们的技术目前用于大量基础研究项目，旨在剖析精氨酸甲基化的病理生理作用。此外，我们正在评估蛋白质精氨酸甲基化作为几种人类疾病中的生物标志物候选物。