该协议非常重要，因为它代表了通过质谱分析蛋白质精氨酸甲基化的全球最先进的工作流程。这是以单一风格分辨率鉴定和分析R-甲基化蛋白质的唯一方法，这是其他生化技术无法实现的。当与PRMT抑制剂的使用相结合时，其中一些抑制剂正在临床试验和抗癌药物中，该协议允许深入分析其作用机制。
首先，使用溶解在终浓度为4.5毫摩尔的超纯水中的DTT储备溶液还原蛋白质的硫醇基团，并在55摄氏度下反应30分钟。通过加入浓度为10毫摩尔的碘乙酰胺并在室温下在黑暗中孵育15分钟来进行蛋白质的硫醇基团的烷基化。为了验证蛋白水解效率，请保存等分试样的蛋白质提取物，以便在SDS-PAGE库马西染色凝胶上进行后续分析，并在消化时将其与相应量的样品进行比较。
用四体积的 20 毫摩尔 HEPES 在 pH 8.0 下稀释剩余的蛋白质提取物，以达到 2 摩尔的最终尿素浓度。将样品分成两部分，然后将测序级修饰胰蛋白酶添加到一部分，将LysargiNase蛋白酶添加到另一部分。将样品在37摄氏度下以每分钟600转的速度在热混合器中过夜，以进行酶消化。
对于每个色谱梯度，将所有级分收集到深 96 孔板中。将梯度开始前收集的分数合并为一个名为pre的单个分数。将高pH反相液相色谱梯度中的60个馏分连接起来，以不连续的方式将它们合并成14个最终馏分。
为了获得非连续的串联，如文本手稿中所述，合并高pH反相部分。将梯度后收集的分数合并为一个名为 post 的唯一分数。分别对来自胰蛋白酶和赖氨酸酶消化的两个样品进行修饰肽的顺序免疫亲和富集。
将10X浓缩免疫亲和纯化或IAP缓冲液稀释10倍。将冻干肽以2， 000 G离心五分钟，将肽旋转到管底部。每15毫升管用250微升稀释的IAP缓冲液重悬肽，并转移到1.5毫升低结合管中。
使用石蕊纸检查pH值是否大于6。保留每个馏分的一小部分等分试样作为后续MS分析的输入。将每个部分分成两部分，以平行进行不对称二甲基化（ADMA）和对称二甲基化（SDMA）肽的免疫富集。
每 10 毫克初始蛋白质提取物制备三瓶与蛋白 A 琼脂糖珠偶联的选定抗泛 R 甲基化抗体。通过将每个小瓶以2， 000 G离心30秒并从磁珠中除去缓冲液，制备与琼脂糖珠偶联的正确量的抗体。用一毫升1X PBS洗涤珠子三次，以2， 000 G离心30秒。
最后一次洗涤后，将珠子重悬于每个小瓶的40微升1X PBS中，将它们合并，然后最终将它们平均分成16个部分。向每个试管中加入250微升1X IAP缓冲液并通过倒置混合。然后将试管在旋转轮上以四摄氏度孵育两个小时。
孵育后，将含有肽的1.5毫升管和pan R-甲基抗体偶联珠以2， 000 G离心30秒以沉淀珠子并将每个级分的流过转移到干净的1.5毫升低结合管中。将磁珠加入与R-mono甲基化抗体偶联的流通液中，并重复重悬到PBS中，用IAP缓冲液孵育并离心。在用单甲基化或MMA珠孵育肽样品期间，用250微升IAP缓冲液洗涤先前用抗ADMA和SDMA免疫沉淀的级分两次，并在每次洗涤后弃去上清液。
然后用LC-MS级水清洗三次。通过向每个试管中加入 50 微升 0.15 TFA，从琼脂糖珠中洗脱亲和富集的 SDMA 或 ADMA 肽。将此溶液在室温下放置10分钟，每两到三分钟倒置一次管。
将第一次洗脱转移到干净的1.5毫升低结合管中，并用50微升0.15TFA重复洗脱。将两个洗脱级分汇集到一个管中。对与抗MMA抗体珠一起孵育的R-单甲基化肽重复此过程。
混合轻标记细胞和重标记细胞后，提取蛋白质并通过胰蛋白酶和赖氨酸酶进行消化。使用SDS-PAGE库马斯染色凝胶验证肽中总蛋白的有效酶消化。评估了C18 Sep-Pak色谱柱纯化步骤的效率，确认了C18色谱柱的流出以及第一次和第二次洗涤中不存在肽，以及它们在淋洗液中的预期存在。
评估了重通道中适当的MET4掺入以及正确的重或轻混合。此处显示了离线高pH反相液相色谱肽分馏和随后馏分的非连续级分串联的色谱图。通过250纳米紫外线检测肽，同时通过280纳米紫外线评估潜在未消化的蛋白质。获得了代表真阳性甲基肽注释的肽的完整MS谱图。
在三个峰之间观察到的M在Z上的差异与酶甲基化残基的存在一致。获得了代表假阳性甲基肽注释的肽的完整MS谱图。在轻甲基化肽与其惩罚性重对应物之间观察到的M在Z上的差异偏离预期值0.0312。
协议工作流程总体上是线性的，但有几个步骤需要特别注意。例如，IPH色谱分离与非连续馏分串联，以及IP设置。相同的方案可以与标准SILAC或无标记定量相结合，以分析精氨酸甲基化动力学，以响应各种扰动。
该协议为表征几种细胞类型和模型系统中蛋白质甲基化的程度和动力学铺平了道路，支持专注于PRMT的基础和转化研究的各个方面。
