该协议显示了使用市售纳米压痕仪测量水凝胶和细胞硬度的分步指南，并且还提供了一个开源软件来可重复地分析采集的数据。然而，该协议允许我们以一小部分的复杂性获得类似原子力显微镜的数据。因此，该协议对于有兴趣研究健康和患病样品的机械性能的科学家很有用，但我们相信它将在软材料的纳米压痕背景下具有更广泛的适用性。
打开仪器并安装所选的实验探头后，开始校准探头。单击软件主窗口中的初始化。在出现的校准菜单中，在输入框中输入探头详细信息。
接下来，用与样品培养皿相同的介质填充一个平底的厚玻璃培养皿，并将培养基的温度与样品的温度相匹配。然后，将校准盘放在探头下方。对于液体校准，用一滴70%乙醇或异丙醇预润湿探头，移液管末端与玻璃套圈轻微接触，使液滴滑过悬臂和球形尖端。
然后，手动将纳米压痕仪的臂向下滑动，直到探针完全浸没但仍远离培养皿底部。等待五分钟，使液体达到平衡条件。接下来，在软件的初始化菜单中，单击扫描波长。
干涉仪的屏幕将显示进度条。通过导航到干涉仪框上的波长扫描面板来检查光学扫描是否成功。然后，在“初始化”菜单中，单击“查找表面”以逐渐降低探头。
探头在接触玻璃培养皿时停止移动。一旦探头与表面接触，使用主软件窗口上的y向下箭头按钮将探头向下移动一微米。观察实时窗口中的绿色信号，以了解每一微米步长的基线变化。
然后，单击初始化菜单中的校准。校准完成后，在弹出的弹窗中检查新旧校准因子。如果新的校准因子在正确的范围内，如手稿中所述，请单击使用新因子。
接下来，将压电陶瓷向上移动 500 微米。然后，通过导航到干涉仪桌面上的解调选项卡来检查解调圈是否已正确校准。轻轻敲击光学工作台或纳米压痕以产生足够的噪音。
离散数据点的白色圆圈应大致覆盖红色圆圈。将含有样品的培养皿加载到显微镜载物台上，并手动将纳米压痕仪的探针移动到样品上方的所需位置。将探针滑入溶液中，注意在探针和样品表面之间留出一到两毫米的距离。
等待五分钟，使探头在溶液中平衡。用光学显微镜聚焦探头。要测量软材料的杨氏模量，请单击配置实验。
在位移控制中添加“查找表面”步骤和单个压痕，以确定随后用于自动矩阵扫描的实验参数。如果单个压痕成功，请配置包含 50 到 100 个点的矩阵扫描，间距为 10 到 100 微米。确保勾选“自动查找表面”框后，单击“使用载物台位置”从当前载物台位置开始矩阵扫描。
在位移控制中设置矩阵扫描配置文件。将段数保留为 5，并使用默认位移配置文件。如有必要，更改每个倾斜段的位移轮廓和时间。
不要超过每秒10微米的应变率。将配置的试验保存在所需的试验路径中。单击“运行实验”，然后等待它完成。
采集完所有数据后，按照文本中的说明清洁探头并关闭仪器。为了筛选力-位移曲线并生成 JSON 格式的清理数据集，请启动准备。py 从实验室计算机上的命令行。
从下拉列表中选择 Optics11 数据格式。如果数据未正确加载，请重新启动图形用户界面并选择Optics11 Old。然后，单击加载文件夹，然后选择包含要分析的数据的文件夹。
使用图形用户界面右侧的选项卡清理数据集。然后，单击“保存 JSON”，并为清理的数据集输入适当的名称。将 JSON 文件发送到安装了 NanoAnalysis 软件的计算机（如果与当前计算机不同）。
启动纳米。来自命令行的 py 文件。在图形用户界面的左上角，单击“加载试验”并选择 JSON 文件。
这将填充文件列表和原始曲线图，根据力-位移曲线显示数据集。在“统计信息”框中，检查三个参数的值：N 已激活、N 失败和 N 已排除。要更详细地可视化特定曲线，请单击该曲线。
这将以绿色突出显示它，并将其显示在当前曲线图上。选择单个曲线后，R 和 k 参数将填充到“统计”框中。进一步清理数据集后，使用“滤波”框中实现的滤波器过滤曲线中的任何噪声。
然后，检查当前曲线图中过滤的曲线。过滤后的曲线为黑色，而未过滤的曲线为绿色。要查找接触点，请从“接触点”框中，选择软件中已实现的一系列数值程序之一。
调整算法的参数以适应数据集，以便正确定位接触点，如手稿中所述。要查看在单条曲线上找到接触点的位置，请通过单击曲线来选取该曲线。然后，单击“检查”。
检查出现的弹出窗口以确定联系人所在的位置。接下来，点击赫兹分析。这将生成三个图形。
检查数据集中每条曲线的力缩进数据，以及以红色显示的平均赫兹拟合。然后，检查平均力压痕曲线，误差带显示一个标准偏差，以及以红色显示的平均赫兹拟合。接下来，检查杨氏模量的散点图，该散点图源自将赫兹模型拟合到每条单独的曲线。
检查“结果”框中的计算均值杨氏模量及其标准差，并确保它们对于给定实验是合理的。然后，在“保存”框中，单击“赫兹”。在弹出窗口中，输入文件名和目录，然后单击保存。
将创建一个 tsv 文件。在任何其他软件中打开 tsv 文件以进行统计分析和进一步绘图。有关细胞纳米压痕数据，请单击弹性光谱分析。
检查生成的两个图，即杨氏模量作为每条曲线压痕深度的函数，以及平均杨氏模量作为双层模型拟合的压痕的函数。分析完成后，单击“保存”框中的“ES”。这将导出指定目录中的 tsv 文件，该文件可以在任何其他选择的软件中打开和绘制。
成功的实验导致力-位移曲线的进近段，具有清晰、平坦的基线、过渡区域和倾斜区域。显示此形状变化的曲线可以使用NanoPrepare轻松地从数据集中删除。此处显示了软聚丙烯酰胺水凝胶和刚性水凝胶的平均力压痕曲线以及平均赫兹模型。
通过绘制杨氏模量的单个值，检索到两种水凝胶的预期平均杨氏模量。对于细胞纳米压痕实验，平均力-压痕曲线和相应的平均赫兹模型表明，赫兹模型不能完全捕捉细胞纳米压痕实验中力随压痕深度增加而演变的情况。这里展示了拟合到200纳米压痕的平均弹性光谱。
平均弹性光谱在200纳米的压痕深度处开始增加，表明基板对探测的表观杨氏模量的贡献。因此，200纳米被选为赫兹和双层模型的拟合范围。拟合双层模型可以提取有关细胞机械状态的更多信息，包括细胞肌动蛋白皮层厚度、细胞肌动蛋白皮层模量和细胞体积模量，如正文中所述。
赫兹模型和弹性谱方法在杨氏模量分布方面的直接比较揭示了与可比均值的重叠分布，证明了弹性谱方法的可行性。准确定位接触点并保持要比较的数据集之间所选算法参数的一致性对于获得样本之间的可靠比较至关重要。该方法普遍适用于量化生物样品的局部弹性特性，包括球状体、类器官、组织以及一般所有软物质。
