이 프로토콜은 상용 나노인덴터를 사용하여 하이드로겔 및 세포의 강성을 측정하는 단계별 가이드를 보여주고 획득한 데이터를 재현 가능하게 분석할 수 있는 오픈 소스 소프트웨어도 제공합니다. 그러나 이 프로토콜을 사용하면 원자력 현미경과 같은 데이터를 훨씬 더 복잡하게 얻을 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 건강하고 병든 샘플의 기계적 특성을 연구하는 데 관심이 있는 과학자들에게 유용할 뿐만 아니라 부드러운 재료에 대한 나노인덴테이션의 맥락에서 더 광범위하게 적용될 수 있을 것이라고 믿습니다.
기기를 켜고 실험을 위해 선택한 프로브를 장착한 후 프로브 교정을 시작합니다. 기본 소프트웨어 창에서 초기화를 클릭합니다. 보정 메뉴가 나타나면 입력 상자에 프로브 세부 정보를 입력합니다.
다음으로, 두꺼운 유리 페트리 접시에 샘플 접시와 동일한 매체로 평평한 바닥을 채우고 매체의 온도를 샘플의 온도와 일치시킵니다. 그런 다음 프로브 아래에 보정 접시를 놓습니다. 액체에서 교정하려면 피펫 끝이 유리 페룰과 가볍게 접촉하도록 70 % 에탄올 또는 이소프로판올 방울로 프로브를 미리 적셔 방울이 캔틸레버 및 구형 팁 위로 미끄러지도록합니다.
그런 다음 프로브가 완전히 잠기지만 페트리 접시 바닥에서 멀리 떨어져 있을 때까지 나노인덴터의 팔을 수동으로 아래쪽으로 밉니다. 액체에서 평형 조건에 도달 할 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 그런 다음 소프트웨어의 초기화 메뉴에서 스캔 파장을 클릭합니다.
간섭계의 화면에 진행률 표시줄이 표시됩니다. 간섭계 상자의 파장 스캔 패널로 이동하여 광학 스캔이 성공했는지 확인합니다. 그런 다음 초기화 메뉴에서 표면 찾기를 클릭하여 프로브를 점진적으로 낮춥니다.
프로브는 유리 페트리 접시에 닿으면 움직이지 않습니다. 프로브가 표면에 닿으면 주 소프트웨어 창의 y 아래쪽 화살표 버튼을 사용하여 프로브를 1마이크로미터 아래로 이동합니다. 각 1마이크로미터 단계에서 기준선의 변화에 대한 라이브 창의 녹색 신호를 관찰합니다.
그런 다음 초기화 메뉴에서 보정을 클릭합니다. 보정이 완료되면 표시된 팝업 창에서 이전 보정 계수와 새 보정 계수를 확인합니다. 원고에 설명된 대로 새 보정 계수가 올바른 범위에 있으면 새 계수 사용을 클릭합니다.
다음으로, 피에조를 500 마이크로 미터 위로 이동하십시오. 그런 다음 간섭계 데스크탑의 복조 탭으로 이동하여 복조 원이 올바르게 보정되었는지 확인합니다. 광학 테이블이나 나노인덴터를 부드럽게 두드려 충분한 소음을 유도합니다.
불연속 데이터 요소의 흰색 원은 빨간색 원을 대략적으로 덮어야 합니다. 샘플이 들어 있는 페트리 접시를 현미경 스테이지에 놓고 나노인덴터의 프로브를 샘플 위의 원하는 위치로 수동으로 이동합니다. 프로브와 샘플 표면 사이에 1-2mm를 남겨 두면서 프로브를 용액에 밀어 넣습니다.
프로브가 용액에서 평형을 이룰 때까지 5분 정도 기다립니다. 광학 현미경으로 프로브에 초점을 맞춥니다. Young의 연질 재료 계수를 측정하려면 실험 구성을 클릭합니다.
표면 찾기 단계와 변위 제어에 단일 들여쓰기를 추가하여 이후에 자동 매트릭스 스캔에 사용할 실험 매개변수를 결정합니다. 단일 압입에 성공하면 10-100마이크로미터 간격으로 50-100개의 포인트가 포함된 매트릭스 스캔을 구성합니다. 표면 자동 찾기 상자가 선택되어 있는지 확인한 후 스테이지 위치 사용을 클릭하여 현재 스테이지 위치에서 매트릭스 스캔을 시작합니다.
변위 제어에서 매트릭스 스캔 프로파일을 설정합니다. 세그먼트 수를 5로 두고 기본 변위 프로파일을 사용합니다. 필요한 경우 각 경사 세그먼트의 변위 프로파일과 시간을 변경합니다.
초당 10마이크로미터를 초과하는 변형률을 초과하지 마십시오. 구성된 실험을 원하는 실험 경로에 저장합니다. 실험 실행을 클릭하고 완료될 때까지 기다립니다.
모든 데이터가 수집되면 프로브를 청소하고 텍스트에 설명된 대로 기기를 끕니다. 힘-변위 곡선을 스크리닝하고 JSON 형식으로 정리된 데이터 세트를 생성하려면 준비를 시작합니다. 랩 컴퓨터의 명령줄에서 py.
드롭다운 목록에서 Optics11 데이터 형식을 선택합니다. 데이터가 올바르게로드되지 않으면 그래픽 사용자 인터페이스를 다시 시작하고 Optics11 Old를 선택하십시오. 그런 다음 폴더 로드를 클릭하고 분석할 데이터가 포함된 폴더를 선택합니다.
그래픽 사용자 인터페이스의 오른쪽에 있는 탭을 사용하여 데이터 세트를 정리합니다. 그런 다음 JSON 저장을 클릭하고 정리된 데이터 세트에 적절한 이름을 입력합니다. 현재 컴퓨터와 다른 경우 NanoAnalysis 소프트웨어가 설치된 컴퓨터로 JSON 파일을 보냅니다.
나노를 시작합니다. 명령 줄에서 py 파일. 그래픽 사용자 인터페이스의 왼쪽 상단에서 실험 로드를 클릭하고 JSON 파일을 선택합니다.
그러면 파일 목록과 힘-변위 곡선의 관점에서 설정된 데이터를 보여주는 원시 곡선 그래프가 채워집니다. 통계 상자에서 세 매개 변수 값 N 활성화, N 실패 및 N 제외를 선택합니다. 특정 곡선을 더 자세히 시각화하려면 곡선을 클릭합니다.
그러면 녹색으로 강조 표시되고 현재 곡선 그래프에 표시됩니다. 단일 곡선을 선택하면 R 및 k 매개 변수가 통계 상자에 채워집니다. 데이터 세트가 추가로 정리되면 필터링 상자에 구현된 필터를 사용하여 곡선의 노이즈를 필터링합니다.
그런 다음 현재 곡선 그래프에서 필터링된 곡선을 검사합니다. 필터링된 곡선은 검은색이고 필터링되지 않은 버전은 녹색입니다. 접점을 찾으려면 접점 상자에서 소프트웨어에 구현된 일련의 숫자 절차 중 하나를 선택합니다.
원고에 설명된 대로 접점이 올바르게 위치하도록 데이터 세트에 맞게 알고리즘의 매개변수를 조정합니다. 단일 커브에서 접촉점이 발견된 위치를 보려면 커브를 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 검사를 클릭합니다.
나타나는 팝업 창을 확인하여 접점이 있는 위치를 식별합니다. 그런 다음 헤르츠 해석을 클릭합니다. 그러면 세 개의 그래프가 생성됩니다.
데이터 세트의 각 곡선에 대한 힘 압입 데이터를 빨간색으로 표시된 평균 Hertz 피팅과 함께 확인합니다. 그런 다음 1 표준 편차를 나타내는 오차 구간이 있는 평균 힘 압입 곡선과 함께 빨간색으로 표시된 평균 Hertz 피팅을 확인합니다. 다음으로, Hertz 모델을 각 개별 곡선에 피팅한 데서 발생하는 영률의 산점도를 확인합니다.
결과 상자에서 계산된 평균 영률과 표준 편차를 검사하고 주어진 실험에 적합한지 확인합니다. 그런 다음 저장 상자에서 Hertz를 클릭합니다. 팝업 창에서 파일 이름과 디렉토리를 입력하고 저장을 클릭합니다.
tsv 파일이 생성됩니다. 통계 분석 및 추가 플로팅을 위해 추가 소프트웨어에서 tsv 파일을 엽니다. 세포 나노인덴테이션 데이터의 경우 탄성 스펙트럼 분석을 클릭합니다.
생성된 두 플롯, 즉 각 곡선에 대한 압입 깊이의 함수로서의 영률과 이중층 모델에 의해 피팅된 압입의 함수로서의 평균 영률 계수를 조사합니다. 분석이 완료되면 저장 상자에서 ES를 클릭합니다. 그러면 지정된 디렉토리의 tsv 파일이 내보내지며 선택한 다른 소프트웨어에서 열고 플롯 할 수 있습니다.
성공적인 실험은 명확하고 평평한 기준선, 전이 영역 및 경사 영역을 갖는 힘-변위 곡선의 접근 세그먼트를 생성합니다. 이 모양의 변화를 보여주는 곡선은 NanoPrepare를 사용하여 데이터 세트에서 쉽게 제거됩니다. 부드러운 폴리아크릴아미드 하이드로겔 및 뻣뻣한 하이드로겔에 대한 평균 Hertz 모델과 함께 평균 힘-압입 곡선이 여기에 표시됩니다.
영률의 개별 값을 플로팅함으로써, 두 하이드로겔 모두에 대해 예상되는 평균 영률이 검색되었다. 세포 나노인덴테이션 실험의 경우, 평균 힘-압흔 곡선과 해당 평균 Hertz 모델은 Hertz 모델이 세포 나노인덴테이션 실험에서 압입 깊이가 증가함에 따라 힘의 진화를 완전히 포착하지 못한다는 것을 보여줍니다. 200나노미터의 압입에 맞는 평균 탄성 스펙트럼이 여기에 나와 있습니다.
평균 탄성 스펙트럼은 200 나노미터의 압입 깊이에서 증가하기 시작하며, 이는 프로빙된 겉보기 영률에 대한 기판의 기여를 나타낸다. 이 때문에 200나노미터가 Hertz 및 이중층 모델 모두의 피팅 범위로 선택되었습니다. 이중층 모델을 피팅하면 본문에 설명된 대로 세포 액틴 피질 두께, 세포 액틴 피질 계수 및 세포 벌크 계수를 포함하여 세포의 기계적 상태에 대한 더 많은 정보를 추출할 수 있습니다.
영률 분포 측면에서 Hertz 모델과 탄성 스펙트럼 접근법을 직접 비교하면 비교 가능한 평균으로 겹치는 분포가 나타나 탄성 스펙트럼 접근법의 타당성을 입증합니다. 접점을 정확하게 찾고 비교하려는 데이터 세트 간에 선택한 알고리즘 매개변수를 일관되게 유지하는 것은 샘플 간의 신뢰할 수 있는 비교를 얻는 데 가장 중요합니다. 이 방법은 스페로이드, 오가노이드, 조직 및 일반적으로 모든 연질 물질을 포함한 생물학적 샘플의 국소 탄성 특성을 정량화하는 데 일반적으로 적용할 수 있습니다.
