Этот протокол показывает пошаговое руководство по измерению жесткости гидрогелей и клеток с использованием коммерчески доступного наноиндентера, а также представляет программное обеспечение с открытым исходным кодом для воспроизводимого анализа полученных данных. Протокол позволяет получить данные, подобные атомно-силовой микроскопии, однако, при небольшой сложности. Таким образом, этот протокол будет полезен для ученых, заинтересованных в изучении механических свойств здоровых и больных образцов, но мы также считаем, что он будет иметь более широкое применение в контексте наноиндентирования для мягких материалов.
После включения прибора и установки выбранного зонда для эксперимента, приступайте к калибровке зонда. Нажмите кнопку Инициализировать в главном окне программного обеспечения. В появившемся меню калибровки введите сведения о зонде в поля ввода.
Затем заполните толстую стеклянную чашку Петри с плоским дном той же средой, что и чашка для образцов, и сопоставьте температуру среды с температурой образца. Затем поместите калибровочную тарелку под зонд. Для калибровки в жидкости предварительно смочите зонд каплей 70% этанола или изопропанола с концом пипетки при легком контакте со стеклянным наконечником, так что капля скользит по консольному и сферическому наконечнику.
Затем вручную сдвиньте руку наноиндентера вниз, пока зонд не будет полностью погружен, но все еще далеко от дна чашки Петри. Подождите пять минут, чтобы обеспечить равновесие в жидкости. Затем в меню инициализации программного обеспечения нажмите «Длина волны сканирования».
На экране интерферометра появится индикатор выполнения. Проверьте, было ли выполнено оптическое сканирование, перейдя на панель «Сканирование по длине волны» на блоке интерферометра. Затем в меню «Инициализация» нажмите «Найти поверхность», чтобы постепенно опустить зонд.
Зонд перестает двигаться, когда он контактирует со стеклянной чашкой Петри. Как только зонд соприкоснется с поверхностью, переместите зонд вниз на один микрометр с помощью кнопки стрелки y вниз в главном окне программного обеспечения. Наблюдайте за зеленым сигналом в динамическом окне для изменений базовой линии с каждым шагом в один микрометр.
Затем нажмите кнопку Калибровка в меню Инициализация. После завершения калибровки проверьте старый и новый коэффициенты калибровки во всплывающем окне. Если новый калибровочный коэффициент находится в правильном диапазоне, как описано в рукописи, нажмите «Использовать новый фактор».
Далее перемещаем вверх пьезо на 500 микрометров. Затем проверьте, правильно ли откалиброван круг демодуляции, перейдя на вкладку Демодуляция на рабочем столе интерферометра. Осторожно нажмите на оптический стол или наноиндентатор, чтобы вызвать достаточно шума.
Белый круг дискретных точек данных должен приблизительно закрывать красный круг. Загрузите чашку Петри, содержащую образец, на ступень микроскопа и вручную переместите зонд наноиндентатора в нужное положение над образцом. Сдвиньте зонд в раствор, позаботившись о том, чтобы оставить один-два миллиметра между зондом и поверхностью образца.
Подождите пять минут, пока зонд уравновесится в растворе. Сосредоточьтесь на зонде с помощью оптического микроскопа. Чтобы измерить модуль мягких материалов Юнга, нажмите «Настроить эксперимент».
Добавьте шаг Find Surface и один отступ в элементе управления перемещением, чтобы определить экспериментальные параметры для последующего использования для автоматического сканирования матрицы. Если одиночный отступ выполнен успешно, настройте матричное сканирование, содержащее от 50 до 100 точек, расположенных на расстоянии от 10 до 100 микрометров. Убедившись, что флажок Автоматический поиск поверхности установлен, щелкните Использовать положение рабочей области, чтобы начать сканирование матрицы с текущего положения этапа.
Настройте профиль матричного сканирования в системе управления перемещением. Оставьте число сегментов равным пяти и используйте профиль смещения по умолчанию. При необходимости измените профиль смещения и время для каждого наклонного сегмента.
Не превышайте скорость деформации более 10 микрометров в секунду. Сохраните настроенный эксперимент в нужном пути эксперимента. Нажмите «Запустить эксперимент» и дождитесь его завершения.
Когда все данные будут получены, очистите зонд и выключите прибор, как описано в тексте. Для скрининга кривых силы-смещения и получения очищенного набора данных в формате JSON, подготовка к запуску. py из командной строки на лабораторном компьютере.
Выберите формат данных Optics11 из выпадающего списка. Если данные загружены неправильно, перезапустите графический интерфейс пользователя и выберите Optics11 Old. Затем нажмите «Загрузить папку» и выберите папку, содержащую данные для анализа.
Очистите набор данных с помощью вкладок, расположенных справа от графического интерфейса пользователя. Затем нажмите «Сохранить JSON» и введите соответствующее имя для очищенного набора данных. Отправьте JSON-файл на компьютер, на котором было установлено программное обеспечение NanoAnalysis, если он отличается от текущего компьютера.
Запустите нано. py из командной строки. В левом верхнем углу графического интерфейса пользователя щелкните Загрузить эксперимент и выберите JSON-файл.
Это заполнит список файлов и график необработанных кривых, показывающий набор данных в терминах кривых силы-смещения. В поле Статистика установите значения трех параметров: N активировано, N failed и N исключено. Чтобы визуализировать конкретную кривую более подробно, нажмите на кривую.
Это выделит его зеленым цветом и покажет на графике текущей кривой. После выбора одной кривой параметры R и k будут заполнены в поле Статистика. После дальнейшей очистки набора данных отфильтруйте любой шум на кривых с помощью фильтров, реализованных в поле Фильтрация.
Затем проверьте отфильтрованные кривые на текущем графике кривых. Отфильтрованная кривая выделена черным цветом, тогда как нефильтрованная версия — зеленой. Чтобы найти контактную точку, в поле Точка контакта выберите одну из серии числовых процедур, реализованных в программном обеспечении.
Настройте параметры алгоритма в соответствии с набором данных, чтобы точка контакта была расположена правильно, как описано в рукописи. Чтобы увидеть, где точка контакта была найдена на одной кривой, выберите кривую, щелкнув по ней. Затем нажмите кнопку Проверить.
Проверьте всплывающее окно, которое отображается, чтобы определить, где находится точка контакта. Затем нажмите на Анализ Герца. Это сгенерирует три графика.
Проверьте данные силового отступа для каждой кривой в наборе данных вместе со средним соответствием Герца, показанным красным цветом. Затем проверьте кривую отступа средней силы с полосой погрешности, показывающей одно стандартное отклонение, вместе со средним припадением Герца, показанным красным цветом. Затем проверьте диаграмму рассеяния модуля Юнга, возникающую из подгонки модели Герца к каждой отдельной кривой.
Проверьте поле Результаты для вычисляемого среднего модуля Юнга и его стандартного отклонения и убедитесь, что они разумны для данного эксперимента. Затем в поле Сохранить нажмите на Hertz. Во всплывающем окне введите имя файла и каталог, а затем нажмите «Сохранить».
Будет создан файл tsv. Откройте файл tsv в любом дополнительном программном обеспечении для статистического анализа и дальнейшего построения графиков. Чтобы получить данные о наноиндентировании клеток, нажмите «Анализ спектров упругости».
Осмотрите два полученных графика, а именно модуль Юнга как функцию глубины отступа для каждой кривой и средний модуль Юнга как функцию отступа, установленного двухслойной моделью. Как только анализ будет завершен, нажмите на ES в поле Сохранить. Это приведет к экспорту файла tsv в указанном каталоге, который можно открыть и построить в любом другом программном обеспечении по выбору.
Успешный эксперимент приводит к тому, что подходный сегмент кривой силы-смещения имеет четкую, плоскую базовую линию, переходную область и наклонную область. Кривые, показывающие изменения этой фигуры, легко удаляются из набора данных с помощью NanoPrepare. Здесь показаны средние кривые силы-отступа вместе со средней моделью Герца для мягкого полиакриламидного гидрогеля и жесткого гидрогеля.
Путем построения индивидуальных значений модуля Юнга для обоих гидрогелей был получен ожидаемый средний модуль Юнга. Для экспериментов с наноиндентацией клеток кривая средней силы-отступа и соответствующая средняя модель Герца демонстрируют, что модель Герца не полностью отражает эволюцию силы с увеличением глубины отступа для экспериментов с наноиндентированием клеток. Здесь демонстрируются средние спектры упругости, установленные до отступа 200 нанометров.
Средние спектры упругости начинают увеличиваться на глубине углубления 200 нанометров, что указывает на вклад подложки в исследуемый кажущийся модуль Юнга. Из-за этого 200 нанометров был выбран в качестве диапазона подгонки как для Hertz, так и для двухслойной модели. Установка двухслойной модели позволяет извлекать больше информации о механическом состоянии клетки, включая толщину коры актина клетки, модуль клеточной актиновой коры и модуль клеточной массы, как объясняется в основном тексте.
Прямое сравнение модели Герца и подхода спектров упругости в терминах распределения модуля Юнга показывает перекрывающиеся распределения с сопоставимыми средними, демонстрируя осуществимость подхода спектров упругости. Точное определение местоположения точки контакта и поддержание согласованности выбранных параметров алгоритма между наборами данных, которые вы хотите сравнить, имеет первостепенное значение для получения надежных сравнений между образцами. Метод имеет общую применимость для количественной оценки локальных эластических свойств биологических образцов, включая сфероиды, органоиды, ткани и в целом все мягкие вещества.
