酿酒酵母驱动蛋白-5 Cin8是一种双向运动蛋白。Cin8作为单个分子在微管的负端方向上移动，并在许多不同的实验条件下改变方向性。我们研究的总体目标是通过研究调节Cin8双向运动性的因素和结构元素来了解双向运动的机制。
该方案全面解释了酵母细胞中GFP型全长Cin8过表达的纯化，单分子运动性测定，以及随后对Cin8单分子和簇的运动特性的分析。这种分离很重要，因为Cin8的方向性受其在微管上的簇状积累的影响。该技术可以很容易地适应从酵母中纯化其他核蛋白。
此外，它可以应用于任何需要根据其荧光强度分离成大小组的荧光颗粒。演示该程序的将是我们的实验室经理Mary Popov博士，Alina Goldstein-Levitin博士和博士后研究员Nurit Siegler博士;Tatiana Zvagelsky，Mayan Sadan和Shira Hershfinkel，研究生;以及Neta Yanir，Yahel Abraham，Roy Avraham和Meital Haberman，来自我们实验室的本科生。首先，生长含有质粒的酿酒酵母细胞，用于过表达Cin8-GFP-6在一升酵母选择性培养基中达到指数生长阶段，在28摄氏度下补充2%棉子糖。
然后通过添加2%半乳糖诱导Cin8-GFP-6His过表达，并通过测量600纳米处的吸光度来监测酵母培养物的生长。加入半乳糖5小时后，离心收获细胞。将细胞重新悬浮在裂解缓冲液中，并在液氮中冷冻。
接下来，使用冷却的研钵和研杵，在液氮中研磨冷冻的细胞。在研磨过程中继续添加液氮，以使提取物保持冷冻状态。在相位或微分干涉对比显微镜下监测细胞裂解。
然后将研磨的细胞解冻，并离心。将上清液加载到装有两毫升镍-NTA的重力流柱上，并用裂解缓冲液预平衡。让上清液流出柱子。
用五列体积的裂解缓冲液洗涤色谱柱，然后用五柱体积的裂解缓冲液补充25毫摩尔咪唑。然后用洗脱缓冲液洗脱Cin8-GFP-6His。通过SDS-PAGE分馏分析洗脱的样品，然后用抗GFP抗体探测考马斯蓝染色和蛋白质印迹分析。
池化含有Cin8-GFP-6His的馏分后，通过尺寸排阻色谱以每分钟0.5毫升的流速和1.5兆帕斯卡的柱压极限纯化它们。同时监测280纳米处的吸光度。收集与Cin8-GFP四聚体相对应的馏分，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹对其进行分析。
然后等分所选馏分，快速冷冻，并储存直至在零下80摄氏度下使用。为了聚合和稳定生物素和罗丹明标记的微管，在1.5毫升管中混合反应组分，并将混合物在37摄氏度下孵育一小时。然后加入80微升温热的普通微管蛋白缓冲液，小心混合，离心。
弃去上清液，并用50微升温的普通微管蛋白缓冲液上下移液，小心地重新悬浮沉淀。然后将悬架存放在28或37摄氏度。使用荧光显微镜检查微管，使用647纳米罗丹明通道。
接下来，从胶带条上取下保护纸，并在胶带上放置硅烷化的盖玻片，以创建三个10微升体积流动室。然后通过顺序添加指示的试剂来执行盖玻片的亲和素包衣。将盖玻片孵育三到五分钟，然后用80微升的普通微管蛋白缓冲液洗涤。
接下来，通过将20微升微管插入流动室，将生物素化的微管连接到b-BSA /亲和素包被的盖玻片上。在室温下，将载玻片朝下在黑暗的湿度室中孵育载玻片，面朝下五分钟。然后用200微升普通微管蛋白缓冲液洗涤载玻片。
接下来，将30微升的运动反应混合物，然后将在20微升运动反应混合物中稀释的Cin8-GFP电机放入流动室中，并立即对电机沿微管的运动进行成像。对于运动运动成像，将一滴浸油放在显微镜物镜上，然后将流动室放在荧光显微镜载物台上，盖玻片面向物镜。打开罗丹明通道，聚焦附着在盖玻片表面的微管上。
然后，使用ImageJ Micro-Manager软件，以20毫秒的曝光获取图像。接下来，打开GFP通道，以1秒的间隔和800毫秒的曝光度采集90张延时图像。在ImageJ Fiji软件中，打开延时短片和相应的微管场图像。
通过选择“分析”，然后选择“工具”和“同步窗口”来同步这两个窗口。要获得kymograph，请使用分段线选项突出显示一个微管。然后，从“分析”中选择“多 Kymograph”选项卡。
要确定Cin8-GFP分子的簇大小，请通过单击“处理”（Process）和“减去背景”（减去背景）来执行背景减法和校正不均匀照明。将滚动球半径设置为 100 像素，然后选中滑动抛物面选项。然后使用ImageJ Fiji软件的TrackMate插件跟踪特定的非运动Cin8-GFP电机。
选择插件，然后选择跟踪，TrackMate，LoG检测器和Simple LAP跟踪器，以跟踪Cin8-GFP电机的平均荧光强度作为四个像素半径的圆圈内的时间函数。在对不同的Cin8-GFP电机重复该过程后，将荧光强度绘制为时间的函数。接下来，为了跟踪Cin8-GFP分子沿微管轨迹的运动性，裁剪要在记录帧的延时序列中分析的微管，方法是使用矩形工具突出显示它并单击图像，然后单击裁剪。
选择荧光Cin8-GFP颗粒进行分析。使用点工具和测量选项记录延时序列中每一帧中的粒子坐标。同样，记录延时序列中其他荧光粒子的坐标。
然后，如前所述，在其外观的第一帧中为所有检查的Cin8-GFP颗粒分配簇大小。接下来，使用指示的公式和确定的Cin8-GFP运动坐标，计算每个时间点相对于初始坐标的Cin8-GFP位移。根据这些位移值，计算指定 Cin8-GFP 粒子的所有可能时间间隔的位移。
对所有检查的Cin8-GFP颗粒重复该过程。最后，绘制所有已检查的Cin8-GFP颗粒的平均位移与时间间隔的关系，并使其进行线性拟合。该拟合的斜率表示运动Cin8-GFP粒子的平均速度。
不同簇大小的双向运动蛋白Cin8在单个微管上的运动特性如下图所示。对于每个聚类大小类别，从记录中提取了40多个单个Cin8-GFP的轨迹。将Cin8电机的单分子和簇的平均位移绘制为时间间隔的函数，表明单个Cin8-GFP分子以单向负端定向方式高速移动。
相比之下，Cin8团簇表现出较低的速度和较高的双向运动性。在执行此程序时，必须使用高纯度的运动蛋白以避免任何可能影响运动聚集的污染物。在分析电机荧光强度时，重要的是要检查它们出现的第一帧中的电机，以避免光漂白的影响。
在研究双向电机的运动性时，分别分析单个分子和团簇非常重要，因为运动聚类是影响运动方向性的关键因素之一。
