Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 является двунаправленным моторным белком. Cin8 движется в направлении минусового конца микротрубочек как единая молекула и изменяет направленность в ряде различных экспериментальных условий. Общая цель нашего исследования состоит в том, чтобы понять механизм двунаправленной подвижности путем изучения факторов и структурных элементов, которые регулируют двунаправленную подвижность Cin8.
Этот протокол всесторонне объясняет очистку полноразмерного Cin8 типа GFP, перевозимого в дрожжевых клетках, анализ подвижности одной молекулы и последующий анализ подвижных свойств отдельных молекул и кластеров Cin8. Это разделение важно, так как на направленность Cin8 влияет его накопление в кластерах на микротрубочках. Этот метод может быть легко адаптирован для очистки других ядерных белков от дрожжей.
Кроме того, он может быть применен к любым флуоресцентным частицам, которые необходимо разделить на группы размеров в зависимости от их интенсивности флуоресценции. Демонстрировать процедуру будут д-р Мария Попова, наш заведующий лабораторией, д-р Алина Гольдштейн-Левитин и д-р Нурит Зиглер, постдокторанты; Татьяна Звагельски, Майян Садан и Шира Хершфинкель, аспиранты; и Нета Янир, Яхель Абрахам, Рой Авраам и Мейтал Хаберман, студенты нашей лаборатории. Для начала вырастите клетки Saccharomyces cerevisiae, содержащие плазмиду для сверхэкспрессии Cin8-GFP-6His в фазу экспоненциального роста в одном литре дрожжеселективной среды, дополненной 2%-рафинозой при 28 градусах Цельсия.
Затем индуцируйте сверхэкспрессию Cin8-GFP-6His, добавляя 2% галактозы, и контролируйте рост культуры дрожжей, измеряя поглощение на 600 нанометрах. Через пять часов после добавления галактозы собирают клетки методом центрифугирования. Повторно приостановите клетки в буфере лизиса и заморозьте их в жидком азоте.
Далее, используя охлажденный раствор и пестик, измельчаем замороженные клетки в жидком азоте. Продолжайте добавлять жидкий азот во время измельчения, чтобы экстракты оставались замороженными. Контролируйте лизис клеток под фазовым или дифференциальным интерференционным контрастным микроскопом.
Затем разморозьте наземные ячейки и центрифугируйте их. Загрузите супернатант на гравитационный столб, заполненный двумя миллилитрами никеля-НТА, и предварительно уравновешивайте его буфером лизиса. Пусть супернатант вытекает через колонну.
Промыть колонну с пятью колонными объемами лизисного буфера, за которыми следуют пять колонных объемов лизисного буфера, дополненного 25-миллимолярным имидазолом. Затем элюируют Cin8-GFP-6His с помощью буфера элюирования. Анализ элюированных образцов методом фракционирования SDS-PAGE с последующим синим окрашиванием Coomassie и анализом вестерн-блот, исследуемым антителами против GFP.
После объединения фракций, содержащих Cin8-GFP-6His, очищают их с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту и пределом давления колонки 1,5 мегапаскалей. Одновременно контролируйте поглощение на 280 нанометров. Соберите фракции, соответствующие тетрамеру Cin8-GFP, и проанализируйте их с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга.
Затем аликвотируйте выбранные фракции, замораживайте и храните до использования при минус 80 градусах Цельсия. Чтобы полимеризовать и стабилизировать микротрубочки, меченые биотином и родамином, смешайте компоненты реакции в 1,5-миллилитровой пробирке и инкубируйте смесь в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. Затем добавьте 80 микролитров теплого общего тубулинового буфера, тщательно перемешайте и центрифугируйте.
Выбросьте супернатант и осторожно приостановите гранулу, пипеткой вверх и вниз 50 микролитров теплого общего буфера тубулина. Затем храните суспензию при 28 или 37 градусах Цельсия. Исследуйте микротрубочки с помощью флуоресцентного микроскопа, используя 647-нанометровый родаминовый канал.
Затем снимите защитную бумагу с ленточных полосок и поместите силанизированный покровный лист на полосы, чтобы создать три 10-микролитрные объемные проточные камеры. Затем выполняют авидиновое покрытие крышки путем последовательного добавления указанных реагентов. Инкубируйте крышку в течение трех-пяти минут, прежде чем промыть ее 80 микролитрами общего тубулинового буфера.
Затем присоедините биотинилированные микротрубочки к покрытым b-BSA/авидином покровам, вставив 20 микролитров микротрубочек в проточную камеру. Высиживайте горки с помощью крышки, обращенной вниз в темной камере влажности в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем промыть горки 200 микролитрами общего тубулинового буфера.
Затем нанесите 30 микролитров реакционной смеси подвижности, затем двигатели Cin8-GFP, разбавленные в 20 микролитрах реакционной смеси подвижности, в проточную камеру, и сразу же приступайте к изображению движения двигателей вдоль микротрубочек. Для визуализации подвижности двигателя поместите каплю погружного масла на объектив микроскопа, затем поместите проточную камеру на ступень флуоресцентного микроскопа, причем крышка обращена к объективу. Включите родаминовый канал, чтобы сфокусироваться на микротрубочках, прикрепленных к поверхности крышки.
Затем, используя программное обеспечение ImageJ Micro-Manager, получите изображение с 20-миллисекундной экспозицией. Затем включите канал GFP и получите 90 покадровых изображений с интервалом в одну секунду и экспозицией 800 миллисекунд. В программном обеспечении ImageJ Fiji откройте покадровый ролик и соответствующее изображение поля микротрубочки.
Синхронизируйте эти два окна, выбрав Анализ, а затем Сервис и Синхронизировать Окна. Чтобы получить кимограф, выделите одну микротрубочку с помощью опции Сегментированная линия. Затем в разделе Анализ выберите вкладку Мульти Кимограф.
Чтобы определить размер кластера молекул Cin8-GFP, выполните вычитание фона и коррекцию неравномерного освещения, щелкнув Процесс, а затем Вычтите фон. Установите радиус шарика в 100 пикселей и установите флажок Скользящий параболоид. Затем отслеживайте конкретный неподвижный двигатель Cin8-GFP с помощью плагина TrackMate программного обеспечения ImageJ Fiji.
Выберите плагины, за которыми следуют Tracking, TrackMate, Детектор LoG и Simple LAP tracker, чтобы следовать средней интенсивности флуоресценции двигателя Cin8-GFP в зависимости от времени в радиусе круга в четыре пикселя. После повторения процедуры для различных двигателей Cin8-GFP постройте график интенсивности флуоресценции как функцию времени. Затем, чтобы отслеживать подвижность молекул Cin8-GFP вдоль дорожек микротрубочек, обрежьте микротрубочки, подлежащие анализу, в покадровой последовательности записанных кадров, выделив ее с помощью инструмента «Прямоугольник» и щелкнув «Изображение», а затем «Обрезка».
Выберите флуоресцентную частицу Cin8-GFP для анализа. Записывайте координаты частиц в каждом кадре покадровой последовательности с помощью инструмента «Точка» и параметров «Измерение». Аналогично записывайте координаты для других флуоресцентных частиц в покадровой последовательности.
Затем назначьте размер кластера всем исследованным частицам Cin8-GFP в первом кадре их появления, как было продемонстрировано ранее. Далее, используя указанную формулу и заданные координаты движения Cin8-GFP, вычисляют смещения Cin8-GFP в каждой точке времени относительно исходных координат. Исходя из этих значений смещения, вычислите смещение для всех возможных временных интервалов для заданной частицы Cin8-GFP.
Повторите процедуру для всех исследованных частиц Cin8-GFP. Наконец, постройте график среднего смещения всех исследованных частиц Cin8-GFP по отношению к временному интервалу и подвергните его линейному соответствию. Наклон этого прилегания представляет собой среднюю скорость подвижных частиц Cin8-GFP.
Здесь показаны характеристики подвижности двунаправленного моторного белка Cin8 различных размеров кластера на одиночных микротрубочках. Для каждой категории размеров кластера из записей было извлечено более 40 траекторий отдельных Cin8-GFP. Построение средних смещений отдельных молекул и кластеров двигателей Cin8 в зависимости от временного интервала показало, что отдельные молекулы Cin8-GFP движутся однонаправленным образом с высокой скоростью.
Напротив, кластеры Cin8 демонстрируют более низкую скорость и более высокую двунаправленную подвижность. При выполнении этой процедуры необходимо использовать моторный белок высокой чистоты, чтобы избежать любых загрязнений, которые могут повлиять на моторную кластеризацию. При анализе интенсивности флуоресценции двигателя важно рассмотреть двигатели в первом кадре, чтобы они появились, чтобы избежать эффекта фотоотбеливания.
При изучении подвижности двунаправленных двигателей крайне важно отдельно анализировать отдельные молекулы и кластеры, так как моторная кластеризация является одним из ключевых факторов, влияющих на направленность движения.
