La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 est une protéine motrice bidirectionnelle. Cin8 se déplace dans la direction de l’extrémité inférieure des microtubules en tant que molécule unique et change de directionnalité dans un certain nombre de conditions expérimentales différentes. L’objectif global de notre recherche est de comprendre le mécanisme de la motilité bidirectionnelle en étudiant les facteurs et les éléments structurels qui régulent la motilité bidirectionnelle de Cin8.
Ce protocole explique de manière exhaustive la purification du Cin8 pleine longueur de type GFP surexprimé dans les cellules de levure, le test de motilité à molécule unique et l’analyse ultérieure des propriétés mobiles des molécules uniques et des amas de Cin8. Cette séparation est importante, car la directionnalité de Cin8 est affectée par son accumulation en grappes sur le microtubule. Cette technique peut être facilement adaptée pour purifier d’autres protéines nucléaires de la levure.
De plus, il peut être appliqué à toutes les particules fluorescentes qui doivent être séparées en groupes de taille en fonction de leur intensité de fluorescence. La Dre Mary Popov, notre directrice de laboratoire, la Dre Alina Goldstein-Levitin, et le Dr Nurit Siegler, boursiers postdoctoraux, feront la démonstration de la procédure; Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan et Shira Hershfinkel, étudiantes diplômées, et Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham et Meital Haberman, étudiantes de premier cycle de notre laboratoire. Pour commencer, cultivez des cellules Saccharomyces cerevisiae contenant le plasmide pour la surexpression de Cin8-GFP-6His à la phase de croissance exponentielle dans un litre de milieu sélectif de levure, complété par 2% de raffinose à 28 degrés Celsius.
Ensuite, induisez la surexpression de Cin8-GFP-6His en ajoutant 2% de galactose, et surveillez la croissance de la culture de levure en mesurant l’absorbance à 600 nanomètres. Cinq heures après l’ajout de galactose, récoltez les cellules par centrifugation. Remettez les cellules en suspension dans un tampon de lyse et congelez-les dans de l’azote liquide.
Ensuite, à l’aide d’un mortier et d’un pilon réfrigérés, broyer les cellules congelées dans de l’azote liquide. Continuez à ajouter de l’azote liquide pendant le broyage, afin que les extraits restent congelés. Surveillez la lyse cellulaire sous un microscope à contraste de phase ou d’interférence différentielle.
Ensuite, décongelez les cellules au sol et centrifugez-les. Chargez le surnageant sur une colonne d’écoulement gravitaire remplie de deux millilitres de nickel-NTA et pré-équilibrez-le avec un tampon de lyse. Laissez le surnageant s’écouler à travers la colonne.
Lavez la colonne avec cinq volumes de colonne de tampon de lyse, suivis de cinq volumes de colonne de tampon de lyse complétés par de l’imidazole de 25 millimolaires. Éluez ensuite le Cin8-GFP-6His avec un tampon d’élution. Analysez les échantillons élués par fractionnement SDS-PAGE, suivi d’une coloration bleue de Coomassie et d’une analyse par transfert Western avec un anticorps anti-GFP.
Après avoir regroupé les fractions contenant du Cin8-GFP-6His, purifiez-les par chromatographie d’exclusion de taille à un débit de 0,5 millilitre par minute et une limite de pression de colonne de 1,5 mégapascals. Surveillez simultanément l’absorbance à 280 nanomètres. Collectez les fractions correspondant au tétramère Cin8-GFP et analysez-les par SDS-PAGE et Western blotting.
Ensuite, aliquotez les fractions sélectionnées, congelez-les instantanément et conservez-les jusqu’à utilisation à moins 80 degrés Celsius. Pour polymériser et stabiliser les microtubules marqués à la biotine et à la rhodamine, mélanger les composants de la réaction dans un tube de 1,5 millilitre et incuber le mélange pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajoutez ensuite 80 microlitres de tampon de tubuline général chaud, mélangez soigneusement et centrifugez.
Jetez le surnageant et remettez-le soigneusement en suspension en pipetant de haut en bas avec 50 microlitres de tampon de tubuline général chaud. Conservez ensuite la suspension à 28 ou 37 degrés Celsius. Examinez les microtubules avec un microscope à fluorescence, en utilisant le canal rhodamine de 647 nanomètres.
Ensuite, retirez le papier protecteur des bandes de ruban adhésif et placez un couvercle silanisé sur les bandes pour créer trois chambres d’écoulement volumétrique de 10 microlitres. Effectuez ensuite le revêtement avidin du couvercle par addition séquentielle des réactifs indiqués. Incuber le couvercle pendant trois à cinq minutes avant de le laver avec 80 microlitres de tampon général à base de tubuline.
Ensuite, fixez les microtubules biotinylés aux couvercles recouverts de b-BSA / avidine en insérant 20 microlitres de microtubules dans la chambre d’écoulement. Incuber les glissières avec le couvercle orienté vers le bas dans une chambre d’humidité sombre pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les lames avec 200 microlitres de tampon général à base de tubuline.
Ensuite, appliquez 30 microlitres de mélange de réaction de motilité suivis de moteurs Cin8-GFP dilués dans 20 microlitres du mélange de réaction de motilité dans la chambre d’écoulement, et procédez immédiatement à l’image du mouvement des moteurs le long des microtubules. Pour l’imagerie de la motilité motrice, placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif du microscope, puis placez la chambre d’écoulement sur l’étage du microscope fluorescent, avec le couvercle tourné vers l’objectif. Activez le canal rhodamine pour vous concentrer sur les microtubules attachés à la surface du couvercle.
Ensuite, à l’aide du logiciel ImageJ Micro-Manager, acquérez l’image avec une exposition de 20 millisecondes. Ensuite, activez le canal GFP et acquérez 90 images time-lapse avec un intervalle d’une seconde et une exposition de 800 millisecondes. Dans le logiciel ImageJ Fiji, ouvrez le film time-lapse et l’image de champ de microtubule correspondante.
Synchronisez ces deux fenêtres en choisissant Analyser, puis Outils et Synchroniser Windows. Pour obtenir un kymographe, mettez en surbrillance un microtubule à l’aide de l’option Ligne segmentée. Ensuite, dans Analyser, sélectionnez l’onglet Multi Kymograph.
Pour déterminer la taille de l’amas des molécules Cin8-GFP, effectuez la soustraction et la correction de fond pour un éclairage inégal en cliquant sur Processus, puis sur Soustraire l’arrière-plan. Réglez le rayon de la boule de roulement sur 100 pixels et cochez l’option Paraboloïde coulissant. Suivez ensuite un moteur Cin8-GFP spécifique non mobile à l’aide du plugin TrackMate du logiciel ImageJ Fiji.
Choisissez Plugins, suivis de Tracking, TrackMate, détecteur LoG et Simple LAP tracker pour suivre l’intensité de fluorescence moyenne du moteur Cin8-GFP en fonction du temps dans un cercle de rayon de quatre pixels. Après avoir répété la procédure pour différents moteurs Cin8-GFP, tracez les intensités de fluorescence en fonction du temps. Ensuite, pour suivre la motilité des molécules Cin8-GFP le long des pistes de microtubules, recadrez les microtubules à analyser dans la séquence time-lapse des images enregistrées en les mettant en surbrillance avec l’outil rectangle et en cliquant sur Image, suivi de Recadrage.
Choisissez une particule fluorescente Cin8-GFP pour l’analyse. Enregistrez les coordonnées des particules dans chaque image de la séquence time-lapse à l’aide de l’outil de point et des options de mesure. De même, enregistrez les coordonnées d’autres particules fluorescentes dans la séquence time-lapse.
Attribuez ensuite la taille du cluster à toutes les particules Cin8-GFP examinées dans la première image de leur apparition, comme démontré précédemment. Ensuite, en utilisant la formule indiquée et les coordonnées de mouvement Cin8-GFP déterminées, calculez les déplacements de Cin8-GFP à chaque point temporel par rapport aux coordonnées initiales. À partir de ces valeurs de déplacement, calculez le déplacement pour tous les intervalles de temps possibles pour une particule Cin8-GFP spécifiée.
Répétez la procédure pour toutes les particules de Cin8-GFP examinées. Enfin, tracez le déplacement moyen de toutes les particules de Cin8-GFP examinées par rapport à l’intervalle de temps et soumettez-le à un ajustement linéaire. La pente de cet ajustement représente la vitesse moyenne des particules mobiles de Cin8-GFP.
Les caractéristiques de motilité de la protéine motrice bidirectionnelle Cin8 de différentes tailles de grappes sur des microtubules simples sont montrées ici. Pour chaque catégorie de taille de grappe, plus de 40 trajectoires de Cin8-GFP individuelles ont été extraites des enregistrements. Le tracé des déplacements moyens de molécules uniques et d’amas de moteurs Cin8 en fonction de l’intervalle de temps a démontré que les molécules uniques de Cin8-GFP se déplacent de manière unidirectionnelle dirigée vers l’extrémité moins avec une vitesse élevée.
En revanche, les amas de Cin8 présentent une vitesse plus faible et une motilité bidirectionnelle plus élevée. Lors de l’exécution de cette procédure, une protéine motrice de haute pureté doit être utilisée pour éviter toute contamination pouvant affecter le regroupement moteur. Lors de l’analyse de l’intensité de fluorescence du moteur, il est important d’examiner les moteurs dans la première image qu’ils apparaissent, afin d’éviter l’effet de photoblanchiment.
Lors de l’étude de la motilité des moteurs bidirectionnels, il est extrêmement important d’analyser séparément les molécules et les grappes individuelles, car le regroupement moteur est l’un des facteurs clés qui affectent la directionnalité motrice.
