Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8은 양방향 운동 단백질입니다. Cin8은 단일 분자로서 미세소관의 마이너스 말단 방향으로 이동하고, 다수의 상이한 실험 조건 하에서 방향성을 변화시킨다. 우리 연구의 전반적인 목표는 Cin8의 양방향 운동성을 조절하는 요인과 구조적 요소를 연구하여 양방향 운동성의 메커니즘을 이해하는 것입니다.
이 프로토콜은 효모 세포에서 과발현된 GFP형 전장 Cin8의 정제, 단일 분자 운동성 분석, 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 운동성 특성의 후속 분석을 종합적으로 설명한다. 이 분리는 Cin8의 방향성이 미세 소관 상의 클러스터에서의 축적에 의해 영향을 받기 때문에 중요합니다. 이 기술은 효모에서 다른 핵 단백질을 정제하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다.
추가적으로, 이들의 형광 강도에 기초하여 크기 그룹으로 분리될 필요가 있는 임의의 형광 입자에 적용될 수 있다. 이 절차를 시연하는 것은 실험실 관리자 인 Mary Popov 박사, Alina Goldstein-Levitin 박사와 박사후 연구원 인 Nurit Siegler 박사가 될 것입니다. Tatiana Zvagelsky, Mayan Sadan, Shira Hershfinkel, 대학원생; Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham, Meital Haberman, 우리 실험실의 학부생. 시작하려면, Cin8-GFP-6His의 과발현을 위한 플라스미드를 함유하는 사카로마이세스 세레비시아 세포를 섭씨 28도에서 2%라피노오스로 보충된 효모 선택 배지 한 리터에서 지수 성장 단계로 성장시킨다.
그 후 2%갈락토오스를 첨가하여 Cin8-GFP-6His 과발현을 유도하고, 600나노미터에서 흡광도를 측정하여 효모 배양 성장을 모니터링하였다. 갈락토오스 첨가 다섯 시간 후, 원심분리에 의해 세포를 수확한다. 세포를 용해 완충액에 재현탁시키고 액체 질소에서 동결시킨다.
다음으로, 냉각된 모르타르 및 유모차를 사용하여, 동결된 세포를 액체 질소에서 분쇄한다. 분쇄하는 동안 액체 질소를 계속 첨가하여 추출물이 동결 된 상태로 유지하십시오. 위상 또는 차등 간섭 대조 현미경으로 세포 용해를 모니터링하십시오.
그런 다음 분쇄 된 세포를 해동하고 원심 분리하십시오. 상층액을 두 밀리리터의 니켈-NTA로 채워진 중력 흐름 컬럼에 적재하고 용해 버퍼로 사전 평형을 이룹니다. 상청액이 기둥을 통해 흘러 나오게하십시오.
컬럼을 5 컬럼 부피의 용해 완충액으로 세척한 다음, 25-밀리몰 이미다졸로 보충된 용해 완충액의 5 컬럼 부피를 가한다. 그런 다음 용출 완충액으로 Cin8-GFP-6His를 용출시킨다. 용출된 샘플을 SDS-PAGE 분획화에 의해 분석하고, 이어서 쿠마시 블루 염색 및 항-GFP 항체로 프로브된 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
Cin8-GFP-6His를 함유하는 분획을 풀링한 후, 분당 0.5 밀리리터의 유속 및 1.5 메가파스칼의 컬럼 압력 한계에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 이들을 정제한다. 동시에 280 나노 미터에서 흡광도를 모니터링합니다. Cin8-GFP 사량체에 상응하는 분획을 수집하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석한다.
그런 다음 선택한 분수를 분취하고, 스냅 동결하고, 영하 80도에서 사용할 때까지 보관하십시오. 비오틴 및 로다민으로 표지된 미세소관을 중합 및 안정화시키기 위해, 반응 성분을 1.5-밀리리터 튜브에 혼합하고, 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 80 마이크로 리터의 따뜻한 일반 튜불린 버퍼를 넣고 조심스럽게 섞은 다음 원심 분리하십시오.
상청액을 버리고, 50 마이크로리터의 따뜻한 일반 튜불린 완충액으로 위아래로 피펫팅하여 펠렛을 조심스럽게 재현탁한다. 그런 다음 서스펜션을 섭씨 28도 또는 37도에 보관하십시오. 647 나노 미터 로다민 채널을 사용하여 형광 현미경으로 미세 소관을 검사하십시오.
그런 다음 테이프 스트립에서 보호 용지를 제거하고 스트립에 실란 화 된 커버 슬립을 배치하여 세 개의 10 마이크로 리터 부피 흐름 챔버를 만듭니다. 그런 다음 지시된 시약을 순차적으로 첨가하여 커버슬립의 아비딘 코팅을 수행한다. 커버슬립을 80 마이크로리터의 일반 튜불린 완충액으로 세척하기 전에 삼 내지 다섯 분 동안 인큐베이션한다.
다음으로, 20 마이크로리터의 미세소관을 유동 챔버에 삽입하여 비오티닐화된 미세소관을 b-BSA/아비딘 코팅 커버슬립에 부착한다. 커버슬립이 아래를 향하도록 슬라이드를 어두운 습도 챔버에서 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 일반 튜불린 버퍼로 슬라이드를 씻으십시오.
다음으로, 30 마이크로리터의 운동성 반응 믹스를 적용한 다음, 운동성 반응 믹스의 20 마이크로리터에 희석된 Cin8-GFP 모터를 유동 챔버 내로 적용하고, 즉시 미세소관을 따라 모터의 움직임을 이미지화하기 위해 진행한다. 모터 운동성 이미징의 경우, 현미경 목표에 침지 오일 한 방울을 놓은 다음 커버슬립이 목표를 향하도록 형광 현미경 스테이지에 유동 챔버를 놓습니다. 로다민 채널을 켜서 커버슬립 표면에 부착된 미세소관에 초점을 맞춥니다.
그런 다음 ImageJ Micro-Manager 소프트웨어를 사용하여 20밀리초 노출로 이미지를 획득합니다. 그런 다음 GFP 채널을 켜고 1초 간격과 800밀리초 노출로 90개의 타임랩스 이미지를 획득합니다. ImageJ 피지 소프트웨어에서 타임랩스 동영상과 해당 미세소관 필드 이미지를 엽니다.
분석을 선택한 다음 도구 및 Windows 동기화를 선택하여 이 두 창을 동기화합니다. 키모그래프를 얻으려면 세그먼트 라인 옵션을 사용하여 하나의 미세소관을 강조 표시합니다. 그런 다음 분석에서 다중 키모그래프 탭을 선택합니다.
Cin8-GFP 분자의 클러스터 크기를 결정하려면 프로세스를 클릭하여 고르지 않은 조명에 대한 배경 뺄셈 및 보정을 수행 한 다음 배경 빼기를 수행하십시오. 롤링 볼 반경을 100픽셀로 설정하고 슬라이딩 포물선 옵션을 확인합니다. 그런 다음 ImageJ 피지 소프트웨어의 TrackMate 플러그인을 사용하여 특정 비운동성 Cin8-GFP 모터를 추적하십시오.
플러그인을 선택한 다음 추적, TrackMate, LoG 검출기 및 단순 LAP 추적기를 선택하여 네 픽셀 반경의 원 내에서 시간의 함수로 Cin8-GFP 모터의 평균 형광 강도를 추적합니다. 다른 Cin8-GFP 모터에 대한 절차를 반복한 후 형광 강도를 시간 함수로 플로팅합니다. 다음으로, 미세소관 트랙을 따라 Cin8-GFP 분자의 운동성을 추적하기 위해, 기록된 프레임의 타임랩스 시퀀스에서 분석될 미세소관을 사각형 도구로 강조 표시하고 이미지를 클릭한 다음, 자르기를 행한다.
분석을 위해 형광 Cin8-GFP 입자를 선택하십시오. 점 도구 및 측정(Measure) 옵션을 사용하여 타임랩스 시퀀스의 각 프레임에 파티클 좌표를 기록합니다. 유사하게, 타임랩스 서열에서 다른 형광 입자에 대한 좌표를 기록한다.
그런 다음 앞에서 설명한 것처럼 외관의 첫 번째 프레임에서 검사된 모든 Cin8-GFP 입자에 클러스터 크기를 할당합니다. 다음으로, 지시된 공식과 결정된 Cin8-GFP 이동 좌표를 사용하여, 초기 좌표에 대하여 각 시점에서의 Cin8-GFP의 변위를 계산한다. 이러한 변위 값으로부터 지정된 Cin8-GFP 입자에 대해 가능한 모든 시간 간격에 대한 변위를 계산합니다.
조사된 모든 Cin8-GFP 입자에 대해 이 과정을 반복한다. 마지막으로, 조사된 모든 Cin8-GFP 입자의 평균 변위 대 시간 간격을 플롯하고, 이를 선형 적합으로 적용한다. 이 적합의 기울기는 운동성 Cin8-GFP 입자의 평균 속도를 나타냅니다.
단일 미세소관 상의 상이한 클러스터 크기의 양방향 모터 단백질 Cin8의 운동성 특성이 여기에 도시되어 있다. 각 군집 크기 범주에 대해, 개별 Cin8-GFP의 40개 이상의 궤적이 기록으로부터 추출되었다. 시간 간격의 함수로 Cin8 모터의 단일 분자 및 클러스터의 평균 변위를 플롯팅한 결과, 단일 Cin8-GFP 분자가 단방향 마이너스 엔드 지향 방식으로 고속으로 이동한다는 것을 입증했습니다.
대조적으로, Cin8 클러스터는 더 낮은 속도와 더 높은 양방향 운동성을 나타낸다. 이 절차를 수행하는 동안 모터 클러스터링에 영향을 줄 수 있는 오염을 피하기 위해 고순도 모터 단백질을 사용해야 합니다. 모터 형광 강도를 분석 할 때 광 표백의 효과를 피하기 위해 모터가 나타나는 첫 번째 프레임에서 모터를 검사하는 것이 중요합니다.
양방향 모터의 운동성을 연구 할 때 모터 클러스터링은 모터 방향성에 영향을 미치는 핵심 요소 중 하나이기 때문에 단일 분자와 클러스터를 별도로 분석하는 것이 매우 중요합니다.
