Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 הוא חלבון מוטורי דו-כיווני. Cin8 נע בכיוון המינוס-קצה של המיקרו-טובולים כמולקולה בודדת, ומשנה את כיווניותו במספר תנאי ניסוי שונים. המטרה הכוללת של המחקר שלנו היא להבין את המנגנון של תנועתיות דו-כיוונית על ידי חקירת גורמים ואלמנטים מבניים המווסתים את תנועתיות הדו-כיוונית של Cin8.
פרוטוקול זה מסביר באופן מקיף את הטיהור של Cin8 באורך מלא מסוג GFP המבוטא יתר בתאי שמרים, את בדיקת התנועתיות של מולקולה אחת, ואת הניתוח שלאחר מכן של תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8. הפרדה זו חשובה, שכן הכיווניות של Cin8 מושפעת מהצטברותו באשכולות על המיקרוטובול. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לטהר חלבונים גרעיניים אחרים מן השמרים.
בנוסף, ניתן ליישם אותו על כל חלקיק פלואורסצנטי שיש להפריד לקבוצות גודל על סמך עוצמת הפלואורסצנציה שלהם. מי שידגימו את ההליך יהיו ד"ר מרי פופוב, מנהלת המעבדה שלנו, ד"ר אלינה גולדשטיין-לויטין, וד"ר נורית זיגלר, פוסט-דוקטורנטית; טטיאנה זבגלסקי, מאיה סדן ושירה הרשפינקל, סטודנטיות לתואר שני, ונתא יניר, יהל אברהם, רועי אברהם ומיטל הברמן, סטודנטיות לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, לגדל Saccharomyces cerevisiae תאים המכילים את הפלסמיד לביטוי יתר של Cin8-GFP-6His לשלב הצמיחה האקספוננציאלית בליטר אחד של מדיום סלקטיבי שמרים, בתוספת 2%רפינוז ב 28 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן לגרום ל-Cin8-GFP-6הבעת יתר על ידי הוספת 2% גלקטוז, ולנטר את צמיחת תרביות השמרים על ידי מדידת ספיגה ב-600 ננומטר. חמש שעות לאחר הוספת גלקטוז, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים במאגר ליזיס, ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי.
לאחר מכן, באמצעות טיט מקורר ומזיק, לטחון את התאים הקפואים בחנקן נוזלי. המשיכו להוסיף חנקן נוזלי במהלך הטחינה, כך שהתמציות יישארו קפואות. עקוב אחר התזה של התא תחת מיקרוסקופ ניגודיות של הפרעה פאזה או דיפרנציאלית.
לאחר מכן להפשיר את תאי הקרקע, ולצנטריפוגות שלהם. טען את הסופרנאטל על עמוד זרימת כבידה מלא בשני מיליליטרים של ניקל-NTA, והשווה אותו מראש עם חיץ ליזיס. תנו לסופר-נאטאנט לזרום החוצה דרך העמודה.
שטפו את העמודה בחמישה כרכים של עמודה של מאגר ליזיס, ואחריהם חמישה כרכים של עמודים של מאגר ליזיס בתוספת אימידזול 25 מילימולרי. לאחר מכן אלחבר את ה- Cin8-GFP-6His עם חיץ אלוטיון. נתחו את הדגימות המבוקרות על ידי פיצול SDS-PAGE, ולאחר מכן את הכתם הכחול של Coomassie וניתוח כתמים מערביים שנבדקו עם נוגדנים נגד GFP.
לאחר איגום השברים המכילים Cin8-GFP-6His, טהרו אותם על ידי כרומטוגרפיית הרחקת גודל בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר לדקה, ומגבלת לחץ עמודה של 1.5 מגה-פסקל. עקוב בו זמנית אחר הספיגה ב-280 ננומטר. אסוף את השברים המתאימים לטטרמר Cin8-GFP ונתח אותם לפי SDS-PAGE וכתם מערבי.
לאחר מכן, בצעו את השברים שנבחרו, הקפאו את ההצמדה ואחסנו עד לשימוש במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לפלפל ולייצב את המיקרוטובולים המסומנים ביוטין ורודמין, ערבבו את רכיבי התגובה בצינור של 1.5 מיליליטר, ודגירו את התערובת למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 80 מיקרוליטרים של חיץ טובולין כללי חם, ערבבו בזהירות וצנטריפוגה.
השליכו את חומר העל, והשעו מחדש את הכדור בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה עם 50 מיקרוליטרים של חיץ טובולין כללי חם. לאחר מכן אחסן את המתלים ב 28 או 37 מעלות צלזיוס. בחנו את המיקרו-טובולים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, באמצעות תעלת הרודמין בת 647 הננומטר.
לאחר מכן, הסר את נייר המגן מרצועות הקלטת והנח כיסוי סילאני על הרצועות כדי ליצור שלושה תאי זרימה בנפח של 10 מיקרוליטר. לאחר מכן לבצע את ציפוי האבידין של הכיסוי על ידי תוספת רציפה של הריאגנטים המצוינים. דגירו את הכיסוי במשך שלוש עד חמש דקות לפני שאתם שוטפים אותו ב-80 מיקרוליטרים של חיץ צינורולין כללי.
לאחר מכן, חברו את המיקרוטובולים שעברו ביוטינילציה לכיסויים המצופים b-BSA/avidin על ידי החדרת 20 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים לתא הזרימה. דגירו את המגלשות כאשר הכיסוי פונה כלפי מטה בתא לחות חשוך למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף את השקופיות עם 200 microliters של חיץ טובולין כללי.
לאחר מכן, יש למרוח 30 מיקרוליטרים של תערובת תגובות תנועתיות ואחריהם מנועי Cin8-GFP המדוללים ב-20 מיקרוליטרים של תערובת תגובת התנועתיות לתוך תא הזרימה, ומיד להמשיך לדמות את תנועת המנועים לאורך המיקרוטובולים. להדמיית תנועתיות מוטורית, הניחו טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ, ולאחר מכן הניחו את תא הזרימה על שלב המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, כאשר הכיסוי פונה למטרה. הפעילו את תעלת הרודמין כדי להתמקד במיקרוטובולים המחוברים למשטח הכיסוי.
לאחר מכן, באמצעות תוכנת ImageJ Micro-Manager, לרכוש את התמונה עם חשיפה של 20 אלפיות השנייה. לאחר מכן, הפעל את ערוץ GFP ורכוש 90 תמונות בהילוך מהיר עם מרווח של שנייה אחת וחשיפה של 800 אלפיות השנייה. בתוכנת ImageJ Fiji, פתח את הסרט בהילוך מהיר ואת תמונת השדה המיקרוטובול המתאימה.
סנכרן שני חלונות אלה על-ידי בחירה באפשרות 'נתח', ואחריו 'כלים' ו'סנכרן את Windows'. כדי לקבל קימוגרף, סמן מיקרוטובול אחד באמצעות האפשרות 'קו מפולח'. לאחר מכן, מתוך ניתוח, בחר בכרטיסייה Multi Kymograph.
כדי לקבוע את גודל האשכול של מולקולות Cin8-GFP, בצע את החיסור והתיקון ברקע להארה לא אחידה על-ידי לחיצה על תהליך, ולאחר מכן על חיסור רקע. הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל ל- 100 פיקסלים, ובדוק את האפשרות פרבולואיד הזזה. לאחר מכן עקוב אחר מנוע Cin8-GFP ספציפי שאינו תנועתי באמצעות תוסף TrackMate של תוכנת ImageJ Fiji.
בחר תוספים, ולאחר מכן מעקב, TrackMate, גלאי LoG וגשש LAP פשוט כדי לעקוב אחר עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של מנוע Cin8-GFP כפונקציה של זמן בתוך מעגל של רדיוס של ארבעה פיקסלים. לאחר חזרה על ההליך עבור מנועי Cin8-GFP שונים, להתוות את עוצמות הפלואורסצנציה כפונקציה של הזמן. לאחר מכן, כדי לעקוב אחר התנועתיות של מולקולות Cin8-GFP לאורך מסלולי המיקרוטובולים, חתוך את המיקרוטובולים לניתוח ברצף קיטועי הזמן של מסגרות מוקלטות על ידי הדגשתו באמצעות כלי המלבן ולחיצה על תמונה, ואחריה חיתוך.
בחר חלקיק Cin8-GFP פלואורסצנטי לניתוח. רשום את קואורדינטות החלקיקים בכל מסגרת של רצף קיטועי הזמן באמצעות כלי הנקודה ואפשרויות המדידה. באופן דומה, רושמים קואורדינטות עבור חלקיקים פלואורסצנטיים אחרים ברצף קיטועי הזמן.
לאחר מכן הקצה את גודל האשכול לכל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו במסגרת הראשונה של הופעתם, כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, באמצעות הנוסחה שצוינה וקואורדינטות התנועה הנקבעות של Cin8-GFP, חישבו את התזוזות של Cin8-GFP בכל נקודת זמן ביחס לקואורדינטות הראשוניות. מתוך ערכי תזוזה אלה, חשב את התזוזה עבור כל מרווחי הזמן האפשריים עבור חלקיק Cin8-GFP שצוין.
חזור על ההליך עבור כל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו. לבסוף, התווה את התזוזה הממוצעת של כל חלקיקי Cin8-GFP שנבדקו לעומת מרווח זמן, והעמיד אותה להתאמה ליניארית. השיפוע של התאמה זו מייצג את המהירות הממוצעת של חלקיקי Cin8-GFP תנועתיים.
מאפייני התנועתיות של החלבון המוטורי הדו-כיווני Cin8 בגדלים שונים של צבירים על מיקרוטובולים בודדים מוצגים כאן. עבור כל קטגוריית גודל אשכול, יותר מ-40 מסלולים של Cin8-GFP בודדים הוצאו מההקלטות. התוויית התזוזות הממוצעות של מולקולות בודדות ואשכולות של מנועי Cin8 כפונקציה של מרווח הזמן הראתה כי מולקולות Cin8-GFP בודדות נעות באופן חד-כיווני מינוס-קצה מכוון במהירות גבוהה.
לעומת זאת, אשכולות Cin8 מפגינים מהירות נמוכה יותר ותנועתיות דו-כיוונית גבוהה יותר. בעת ביצוע הליך זה, יש להשתמש בחלבון מוטורי בטוהר גבוה כדי למנוע זיהומים שיכולים להשפיע על אשכולות מוטוריים. בניתוח עוצמת הפלואורסצנציה המוטורית, חשוב לבחון את המנועים במסגרת הראשונה שהם מופיעים, כדי למנוע את ההשפעה של הלבנת תמונות.
כאשר חוקרים את תנועתיות המנועים הדו-כיווניים, חשוב מאוד לנתח בנפרד מולקולות ואשכולות בודדים, שכן אשכולות מוטוריים הם אחד הגורמים המרכזיים המשפיעים על כיווניות המנוע.
