从小鼠垂体中开发类器官作为 体外 模型以探索垂体干细胞生物学

我们的类器官模型对于探索稳态和垂体重塑条件下的垂体干细胞生物学非常有价值，例如腺体的新生儿成熟，衰老相关的功能下降和腺体中的肿瘤生长。迄今为止，我们的垂体类器官技术是唯一可用工具，可以可靠而稳健地生长和扩增原代小鼠垂体干细胞。演示该程序的将是Emma Laporte和Charlotte Nys，他们是我研究小组的博士生。

首先，用去离子水清洗小鼠头以除去血液。在头上喷洒70%乙醇，以产生无菌环境。然后，使用无菌手术工具去除耳朵之间的皮肤。

要打开颅骨，请用无菌剪刀打破鼻梁。进一步打开颅骨，从鼻梁开始，朝向两侧的耳朵。用无菌镊子去除颅骨和大脑，而不接触垂体。

用钝镊子取下膈肌。然后，在立体显微镜下，将前叶与后叶和中间叶分开。用钝镊子小心地分离前叶，并将其收集在含有三毫升培养基A的10毫升锥形瓶中.加入两毫升预热的2.5%胰蛋白酶溶液。

在37摄氏度下孵育15分钟。加入两毫升预热的DNAse溶液，并在锥形瓶中旋转10次。让垂体沉入底部并除去上清液。

加入两毫升预热的胰蛋白酶抑制剂溶液，并在37摄氏度下孵育10分钟。当垂体沉入底部时，取出上清液。加入两毫升预热培养基B并孵育五分钟。

向其中加入两毫升预热的培养基C，孵育15分钟。让垂体沉入底部并除去上清液。然后，用预热的培养基C冲洗三次，加入两毫升预热的培养基C.吸出物，并用无菌的火焰抛光巴斯德移液管多次排出垂体，直到碎片不再可见。

将悬浮液转移到含有4.5毫升预热DNAse溶液的15毫升管中。用两毫升预热的培养基C冲洗烧瓶三次，并将悬浮液转移到管中。混合收集的细胞悬浮液，并通过40微米细胞过滤器将其过滤到30毫升管中。

用两毫升培养基C冲洗管和细胞过滤器三次，并将悬浮液转移到管中。在玻璃巴斯德移液器中加入两毫升BSA。将移液器的尖端放在管的底部，轻轻移液以形成可见的密度层。

在4摄氏度下以190倍G离心10分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于一毫升冰冷的高级DMEM / F-12中。然后，用细胞计数器量化细胞。

将细胞悬浮液在4摄氏度下以190倍G离心10分钟，并除去上清液。将细胞沉淀重悬于先进的DMEM / F-12中，以达到每毫升10至第6个细胞的1.1倍的细胞密度。以30:70的比例将ECM加入所需体积的细胞悬浮液中，并充分混合。

将30微升的该混合物滴入预热的48孔板的每个孔中。将板倒置，让 ECM 在 37 摄氏度下固化 20 分钟。孵育后，小心地加入250微升预热的垂体类器官培养基，补充10微摩尔ROCK抑制剂。

每两到三天，更换没有ROCK抑制剂的培养基10至14天，直到类器官完全生长。要通过类器官，首先轻轻吸出培养基，并加入400微升冰冷的高级DMEM / F-12以分解ECM。然后，将类器官收集在微量离心管中。

用400微升冰冷的高级DMEM / F-12清洗井。将管子以200倍G在四摄氏度下离心五分钟。除去上清液并加入400微升预热的TrypLE Express酶。

通过倒置管子几次混合，并在37摄氏度下孵育五分钟。加入400微升冰冷的高级DMEM/F-12。在4摄氏度下以200倍G离心5分钟，并除去上清液。

用100微升冰冷的高级DMEM / F-12重悬沉淀。缩小P-200尖端，并使用尖端通过剧烈移液来解离类器官，直到获得类器官碎片。添加 800 微升高级 DMEM/F-12。

在4摄氏度下以190倍G离心10分钟，并除去上清液。为了通过类器官，将沉淀重悬于足够体积的高级DMEM / F-12中，并以30:70的比例加入ECM。搅拌均匀。

继续播种和培养类器官，如文本手稿中所述。将来自前叶的解离单细胞接种在ECM中并在垂体类器官培养基中生长。播种14天后，类器官发育完全，直径可达500微米。

在这个阶段，类器官表现出囊性形态，上皮层包围着一个管腔。不建议使用生长后出现致密结构的孔。对于传代，使用类器官碎片进行播种。

传代后7天，观察到囊性结构的类器官再生有利。应丢弃致密类器官，因为不利的类器官可能会接管培养物。上皮标志物E-钙粘蛋白和细胞角蛋白8和18的免疫荧光染色分析证实了类器官的上皮特征。

垂体干细胞标志物Sox2和Trop2的表达证明了其干性，垂体特异性标志物LHX3显示了垂体类器官的表型。标记物Ki67的表达表明构成类器官的细胞处于增殖状态。RTQ PCR分析显示，即使在多次传代后，类器官中干性标志物的表达也高于前叶，证实了干细胞的富集。

重要的是在初始接种时在ECM圆顶中接种适当数量的单细胞，并且在传代类器官时，必须记住重新接种片段而不是单细胞。