Nosso modelo organoide é altamente valioso para explorar a biologia das células-tronco pituitárias em condições de remodelação homeostática, bem como em condições de remodelação pituitária, como na maturação neonatal da glândula, declínio funcional associado ao envelhecimento e crescimento tumoral na glândula. Até o momento, nossa técnica organoide pituitária é a única ferramenta disponível para crescer e expandir as células-tronco primárias do rato. Demonstrando o procedimento estarão Emma Laporte e Charlotte Nys, doutorandas do meu grupo de pesquisa.
Para começar, lave a cabeça do rato com água deionizada para remover o sangue. Pulverizar 70% de etanol na cabeça para gerar um ambiente estéril. Em seguida, remova a pele entre as orelhas usando ferramentas cirúrgicas estéreis.
Para abrir o crânio, quebre a ponte do nariz com uma tesoura estéril. Abra ainda mais o crânio a partir da ponte do nariz em direção às orelhas de ambos os lados. Remova o crânio e o cérebro com pinças estéreis sem tocar na glândula pituitária.
Remova o diafragma sellae com pinças cegas. Em seguida, sob um estereótipo, separe o lobo anterior dos lóbulos posteriores e intermediários. Isole cuidadosamente o lobo anterior com pinças cegas e colete-o em um frasco de Erlenmeyer de 10 mililitros contendo três mililitros de médio A.Adicione dois mililitros de solução de trippsina pré-aquecida de 2,5%.
Incubar a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione dois mililitros de solução DNAse pré-aquecida e gire o frasco Erlenmeyer 10 vezes. Deixe a hipófise afundar até o fundo e remova o supernatante.
Adicione dois mililitros de solução inibidora de trippsina pré-aquecida e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Remova o supernatante quando a pituitária afundar até o fundo. Adicione dois mililitros de B médio pré-aquecido e incubar por cinco minutos.
Adicione dois mililitros de médio C pré-aquecidos a isso e incubar por 15 minutos. Deixe a hipófise afundar até o fundo e remova o supernatante. Em seguida, enxágüe-o três vezes com ceta de pasteur médio pré-aquecido várias vezes até que os fragmentos não sejam mais visíveis.
Transfira a suspensão para um tubo de 15 mililitros contendo 4,5 mililitros de solução DNAse pré-aquecida. Enxágüe o frasco três vezes com dois mililitros de C médio pré-aquecido e transfira a suspensão para o tubo. Misture a suspensão celular coletada e filtre-a através de um coador de células de 40 mícrons em um tubo de 30 mililitros.
Enxágüe o tubo e o coador celular três vezes com dois mililitros de C médio e transfira a suspensão para o tubo. Encha uma pipeta pasteur de vidro com dois mililitros de BSA. Posicione a ponta da pipeta na parte inferior do tubo e pipeta suavemente para fora para formar uma camada de densidade visível.
Centrifugar a 190 vezes G por 10 minutos a 4 graus Celsius. Remova o supernasce e resuspende a pelota celular em um mililitro de DMEM/F-12 avançado gelado. Em seguida, quantifique as células com um contador celular.
Centrifugar a suspensão celular a 190 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante. Resuspende a pelota celular em DMEM/F-12 avançado para atingir uma densidade celular de 1,1 vezes 10 a 6ª células por mililitro. Adicione ECM ao volume desejado de suspensão celular a uma proporção de 30:70 e misture bem.
Deposite uma gota de 30 microliter desta mistura em cada poço de uma placa pré-aquecida de 48 poços. Vire a placa de cabeça para baixo e deixe o ECM solidificar a 37 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, adicione cuidadosamente 250 microliters de meio organoide pituitário pré-aquecido complementado com inibidor rock de 10 micromolar.
A cada dois ou três dias, troque o meio sem inibidor de ROCHA por 10 a 14 dias até que os organoides estejam totalmente crescidos. Para passar os organoides, primeiro aspire o meio suavemente e adicione 400 microliters de DMEM/F-12 avançados para desintegrar o ECM. Em seguida, colete os organoides em um tubo de microcentrifuuge.
Lave o poço com 400 microliters de DMEM/F-12 avançados em gelo. Centrifugar o tubo a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o supernatante e adicione 400 microliters de enzima TrypLE Express pré-aquecida.
Misture invertendo o tubo várias vezes e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos. Adicione 400 microliters de DMEM/F-12 avançados em gelo. Centrifugar a 200 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante.
Resuspenja a pelota com 100 microliters de DMEM/F-12 avançados em gelo. Reduza uma ponta P-200 e use a ponta para dissociar os organoides, esbofoque vigorosamente até que os fragmentos organoides sejam obtidos. Adicione 800 microliters de DMEM/F-12 avançados.
Centrifugar a 190 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e remover o supernante. Para passar os organoides, resuspenco a pelota em um volume adequado de DMEM/F-12 avançado e adicione ECM a uma razão de 30:70. Misture bem.
Continuem a semear e cultivar os organoides como descrito no manuscrito do texto. Células únicas dissociadas do lobo anterior foram semeadas em ECM e cultivadas em meio organoide pituitário. 14 dias após a semeadura, os organoides foram totalmente desenvolvidos e atingiram um diâmetro de até 500 micrômetros.
Nesta fase, os organoides apresentaram morfologia cística com uma camada epitelial envolvendo um lúmen. Não é recomendável usar os poços em que estruturas densas aparecem após o crescimento. Para a troca, fragmentos organoides foram usados para semeadura.
Sete dias após a passagem, observou-se crescimento organoide favorável com estruturas císticas. Organoides densos devem ser descartados, pois os organoides desfavoráveis podem assumir a cultura. A análise de coloração da imunofluorescência para os marcadores epiteliais E-cadherin e citokeratins 8 e 18 confirmaram o caráter epitelial dos organoides.
A expressão dos marcadores de células-tronco pituitárias Sox2 e Trop2 demonstrou a haste, e o marcador lHX3 específico da hipófise mostrou fenótipo pituitário dos organoides. A expressão do marcador Ki67 mostrou que as células que constituem organoides estão em estado de proliferação. A análise do RTQ PCR mostrou maior expressão de marcadores de caule nos organoides do que no lobo anterior mesmo após múltiplas passagens, validando o enriquecimento das células-tronco.
É importante emplacar o número adequado de células únicas na cúpula ECM na semeadura inicial, e ao passar os organoides, deve-se lembrar de re-sementes fragmentos e não células únicas.
