Nuestro modelo organoide es muy valioso para explorar la biología de las células madre hipofisarias en condiciones homeostáticas y de remodelación hipofisaria, como en la maduración neonatal de la glándula, el deterioro funcional asociado al envejecimiento y el crecimiento tumoral en la glándula. Hasta la fecha, nuestra técnica de organoides hipofisarios es la única herramienta disponible para crecer y expandir de manera confiable y robusta las células madre hipofisarias primarias del ratón. Demostrando el procedimiento estarán Emma Laporte y Charlotte Nys, estudiantes de doctorado en mi grupo de investigación.
Para comenzar, lave la cabeza del ratón con agua desionizada para eliminar la sangre. Rocíe etanol al 70% en la cabeza para generar un ambiente estéril. Luego, retire la piel entre las orejas con herramientas quirúrgicas estériles.
Para abrir el cráneo, rompa el puente de la nariz con tijeras estériles. Abra aún más el cráneo a partir del puente de la nariz hacia las orejas en ambos lados. Retire el cráneo y el cerebro con pinzas estériles sin tocar la glándula pituitaria.
Retire las sillas de diafragma con pinzas romas. Luego, bajo un estereomicroscopio, separe el lóbulo anterior de los lóbulos posterior e intermedio. Aísle cuidadosamente el lóbulo anterior con pinzas romas y recójalo en un matraz Erlenmeyer de 10 mililitros que contenga tres mililitros de A mediano.Agregue dos mililitros de solución de tripsina al 2,5% precalentada.
Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue dos mililitros de solución de DNAse precalentada y revuelva el matraz Erlenmeyer 10 veces. Deje que la hipófisis se hunda hasta el fondo y retire el sobrenadante.
Agregue dos mililitros de solución inhibidora de tripsina precalentada e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante cuando la hipófisis se hunda hasta el fondo. Agregue dos mililitros de B medio precalentado e incube durante cinco minutos.
Agregue dos mililitros de C medio precalentado a esto e incube durante 15 minutos. Deje que la hipófisis se hunda hasta el fondo y retire el sobrenadante. Luego, enjuáguelo tres veces con C medio precalentado.Agregue dos mililitros de C.Aspirado medio precalentado y expulse la glándula pituitaria con una pipeta Pasteur estéril y pulida al llama varias veces hasta que los fragmentos ya no sean visibles.
Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros que contenga 4,5 mililitros de solución de DNAsa precalentada. Enjuague el matraz tres veces con dos mililitros de C medio precalentado y transfiera la suspensión al tubo. Mezcle la suspensión celular recolectada y filtre a través de un colador celular de 40 micras en un tubo de 30 mililitros.
Enjuague el tubo y el colador celular tres veces con dos mililitros de C medio y transfiera la suspensión al tubo. Llene una pipeta Pasteur de vidrio con dos mililitros de BSA. Coloque la punta de la pipeta en la parte inferior del tubo y salga suavemente para formar una capa de densidad visible.
Centrifugar a 190 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender la bolita celular en un mililitro de DMEM/F-12 avanzado helado. Luego, cuantifique las celdas con un contador de celdas.
Centrifugar la suspensión celular a 190 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. Resuspend el pellet celular en DMEM/F-12 avanzado para alcanzar una densidad celular de 1,1 veces 10 a las 6ª células por mililitro. Agregue ECM al volumen deseado de suspensión celular en una proporción de 30:70 y mezcle bien.
Deposite una gota de 30 microlitros de esta mezcla en cada pocillo de una placa de 48 pocillos precalentada. Gire la placa boca abajo y deje que el ECM se solidifique a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, agregue cuidadosamente 250 microlitros de medio organoide hipofisario precalentado complementado con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares.
Cada dos o tres días, cambie el medio sin inhibidor de ROCK durante 10 a 14 días hasta que los organoides estén completamente desarrollados. Para pasar los organoides, primero aspire el medio suavemente y agregue 400 microlitros de DMEM / F-12 avanzado en frío para desintegrar el ECM. Luego, recoja los organoides en un tubo de microcentrífuga.
Lave el pozo con 400 microlitros de DMEM/F-12 avanzados en frío. Centrifugar el tubo a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y agregue 400 microlitros de enzima TrypLE Express precalentada.
Mezclar invirtiendo el tubo varias veces e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Agregue 400 microlitros de DMEM/F-12 avanzado en frío helado. Centrifugar a 200 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.
Resuspend el pellet con 100 microlitros de DMEM/F-12 avanzado en frío. Estreche una punta P-200 y use la punta para disociar los organoides mediante el pipeteo vigoroso hasta que se obtengan fragmentos de organoides. Agregue 800 microlitros de DMEM / F-12 avanzado.
Centrifugar a 190 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante. Para pasar los organoides, resuspenda el pellet en un volumen adecuado de DMEM / F-12 avanzado y agregue ECM en una proporción de 30: 70. Mezclar bien.
Continúe sembrando y cultivando los organoides como se describe en el manuscrito de texto. Las células individuales disociadas del lóbulo anterior se sembraron en ECM y se cultivaron en medio organoide pituitario. 14 días después de la siembra, los organoides estaban completamente desarrollados y alcanzaron un diámetro de hasta 500 micrómetros.
En esta etapa, los organoides exhibieron morfología quística con una capa epitelial que encierra un lumen. No se recomienda usar los pozos en los que aparecen estructuras densas después del crecimiento. Para el pasaje, se utilizaron fragmentos organoides para la siembra.
Siete días después del pasaje, se observó un rebrote organoide favorable con estructuras quísticas. Los organoides densos deben descartarse, ya que los organoides desfavorables pueden apoderarse del cultivo. El análisis de tinción por inmunofluorescencia para los marcadores epiteliales E-cadherina y citoqueratinas 8 y 18 confirmó el carácter epitelial de los organoides.
La expresión de los marcadores de células madre hipofisarias Sox2 y Trop2 demostró el tallo, y el marcador específico de la hipófisis LHX3 mostró el fenotipo hipofisario de los organoides. La expresión del marcador Ki67 mostró que las células organoides constituyentes se encuentran en un estado proliferativo. El análisis RTQ PCR mostró una mayor expresión de marcadores de tallo en los organoides que en el lóbulo anterior incluso después de múltiples pasajes, validando el enriquecimiento de las células madre.
Es importante colocar el número apropiado de células individuales en la cúpula de ECM en la siembra inicial, y al pasar los organoides, uno debe recordar volver a sembrar fragmentos y no células individuales.
