Organoid modelimiz, hipofiz kök hücre biyolojisini homeostatiğin yanı sıra bezin yenidoğan olgunlaşması, yaşlanmaya bağlı fonksiyonel düşüş ve bezdeki tümör büyümesi gibi hipofiz yeniden yapılanma koşullarında keşfetmek için oldukça değerlidir. Bugüne kadar, hipofiz organoid tekniğimiz, birincil fare hipofiz kök hücrelerini güvenilir ve sağlam bir şekilde büyütmek ve genişletmek için mevcut tek araçtır. Prosedürü gösteren, araştırma grubumdaki doktora öğrencileri Emma Laporte ve Charlotte Nys olacak.
Başlamak için, kanı çıkarmak için fare kafasını deiyonize suyla yıkayın. Steril bir ortam oluşturmak için kafaya% 70 etanol püskürtün. Daha sonra, steril cerrahi aletler kullanarak kulaklar arasındaki cildi çıkarın.
Kafatasını açmak için burun köprüsünü steril makasla kırın. Burun köprüsünden başlayarak kafatasını her iki taraftaki kulaklara doğru daha da açın. Kafatasını ve beyni hipofiz bezine dokunmadan steril cımbızla çıkarın.
Diyafram sellae'yi künt cımbızla çıkarın. Daha sonra, bir stereomikroskop altında, ön lobu arka ve ara loblardan ayırın. Ön lobu künt cımbızla dikkatlice izole edin ve üç mililitre orta A.İki mililitre önceden ısıtılmış% 2.5 tripsin çözeltisi içeren 10 mililitrelik bir Erlenmeyer şişesinde toplayın.
15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İki mililitre önceden ısıtılmış DNAse çözeltisi ekleyin ve Erlenmeyer şişesini 10 kez döndürün. Hipofizin dibe batmasına izin verin ve süpernatanı çıkarın.
İki mililitre önceden ısıtılmış tripsin inhibitörü çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hipofiz dibe battığında süpernatantı çıkarın. İki mililitre önceden ısıtılmış orta B ekleyin ve beş dakika boyunca inkübe edin.
Buna iki mililitre önceden ısıtılmış orta C ekleyin ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Hipofizin dibe batmasına izin verin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra, önceden ısıtılmış orta C.İki mililitre önceden ısıtılmış ortam C.Aspirate ekleyin ve hipofiz bezini steril, alevle parlatılmış bir Pasteur pipetle parçalar artık görünmeyene kadar birkaç kez dışarı atın.
Süspansiyonu, 4.5 mililitre önceden ısıtılmış DNAse çözeltisi içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Şişeyi iki mililitre önceden ısıtılmış orta C ile üç kez durulayın ve süspansiyonu tüpe aktarın. Toplanan hücre süspansiyonunu karıştırın ve 40 mikronluk bir hücre süzgecinden 30 mililitrelik bir tüpe süzün.
Tüpü ve hücre süzgecini iki mililitre orta C ile üç kez durulayın ve süspansiyonu tüpe aktarın. Bir cam Pasteur pipeti iki mililitre BSA ile doldurun. Pipetin ucunu tüpün altına yerleştirin ve görünür bir yoğunluk tabakası oluşturmak için pipeti yavaşça dışarı çıkarın.
Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 190 kez G'de santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini bir mililitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM / F-12 içinde yeniden askıya alın. Ardından, hücreleri bir hücre sayacı ile sayısallaştırın.
Hücre süspansiyonunu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 190 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Hücre peletini ileri DMEM / F-12'de yeniden askıya alarak mililitre başına 1.1 kat 10 ila 6. hücreye kadar bir hücre yoğunluğuna ulaşın. İstenilen hücre süspansiyonu hacmine 30:70 oranında ECM ekleyin ve iyice karıştırın.
Bu karışımın 30 mikrolitrelik bir damlasını, önceden ısıtılmış 48 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna koyun. Plakayı baş aşağı çevirin ve ECM'nin 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede katılaşmasına izin verin. Kuluçkadan sonra, 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 250 mikrolitre önceden ısıtılmış hipofiz organoid ortamını dikkatlice ekleyin.
Her iki ila üç günde bir, organoidler tamamen büyüyene kadar 10 ila 14 gün boyunca ROCK inhibitörü olmadan ortamı değiştirin. Organoidleri geçmek için, önce ortamı nazikçe aspire edin ve ECM'yi parçalamak için 400 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin. Ardından, organoidleri bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
Kuyuyu 400 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM / F-12 ile yıkayın. Tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve 400 mikrolitre önceden ısıtılmış TripLE Express enzimi ekleyin.
Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. 400 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın.
Peleti 100 mikrolitre buz gibi soğuk gelişmiş DMEM / F-12 ile yeniden askıya alın. Bir P-200 ucunu daraltın ve organoid parçaları elde edilene kadar kuvvetli pipetleme yaparak organoidleri ayırmak için ucu kullanın. 800 mikrolitre gelişmiş DMEM / F-12 ekleyin.
Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 190 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Organoidleri geçmek için, peleti yeterli miktarda gelişmiş DMEM / F-12'de yeniden askıya alın ve 30:70 oranında ECM ekleyin. İyice karıştırın.
Metin el yazmasında açıklandığı gibi organoidleri tohumlamaya ve kültürlemeye devam edin. Ön lobdan ayrışmış tek hücreler ECM'de tohumlandı ve hipofiz organoid ortamında yetiştirildi. Tohumlamadan 14 gün sonra, organoidler tamamen geliştirildi ve 500 mikrometreye kadar bir çapa ulaştı.
Bu aşamada, organoidler bir lümeni çevreleyen epitel tabakası ile kistik morfoloji sergilediler. Büyümeden sonra yoğun yapıların ortaya çıktığı kuyucukların kullanılması önerilmez. Pasaj için, tohumlama için organoid fragmanlar kullanıldı.
Pasajdan yedi gün sonra, kistik yapılarda olumlu organoid yeniden büyüme gözlendi. Olumsuz organoidler kültürü ele geçirebileceğinden, yoğun organoidler atılmalıdır. Epitel belirteçleri E-kadherin ve sitokeratinler 8 ve 18 için immünofloresan boyama analizi, organoidlerin epitel karakterini doğruladı.
Hipofiz kök hücre belirteçleri Sox2 ve Trop2'nin ekspresyonu saplığı gösterdi ve hipofiz spesifik belirteç LHX3, organoidlerin hipofiz fenotipini gösterdi. Ki67 belirtecinin ekspresyonu, organoid oluşturan hücrelerin proliferatif bir durumda olduğunu göstermiştir. RTQ PCR analizi, organoidlerde kök belirteçlerinin çoklu pasajlardan sonra bile ön lobdan daha yüksek ekspresyonunu gösterdi ve kök hücrelerin zenginleşmesini doğruladı.
İlk tohumlamada ECM kubbesindeki uygun sayıda tek hücrenin plakalanması önemlidir ve organoidleri geçirirken, tek hücreleri değil, parçaları yeniden tohumlamayı hatırlamak gerekir.
