本视频的目的是描述Descemet's Striping Only的人类角膜器官培养模型，该模型具有加速愈合，由工程成纤维细胞生长因子1刺激。Fuch的内皮角膜营养不良症（FECD）是一种疾病，其特征在于角膜内皮细胞的泵功能丧失以及Descemet膜表面胶原蛋白和其他细胞外基质蛋白的过度积聚，形成角膜内皮。FECD唯一已知的治疗方法是各种形式的内皮角膜移植术，所有这些都有排斥和内皮细胞丢失的风险。
虽然眼科手术的进步使这些手术随着时间的推移变得不那么具有侵入性，但任何形式的移植都伴随着排斥的风险和终身使用类固醇的可能性。Descemet的仅剥离或DSO是一种实验性替代方案，其中FECD患者将牙本质定位在角膜中心，在没有移植物置换的情况下去除Descemet膜的中心四毫米圆。去除牙龈瘤可促进健康的外周细胞向内迁移并修复内皮单层，最终逆转基质水肿并改善视力。
虽然这种方法有很多优点，但愈合过程漫长且不一致，如果在手术后的一个月内没有看到愈合，一些患者需要抢救移植。DSO后刺激伤口更快愈合的治疗可能使该手术成为FECD患者更可行的选择。该协议使用人类供体角膜以器官培养形式对临床DSO程序进行建模，目的是测试治疗以改善DSO后的伤口愈合，使DSO成为FECD患者更可行的选择。
我们的实验室使用此模型来测试用工程成纤维细胞生长因子处理的角膜的伤口愈合，我们将在本视频的后面部分显示具有代表性的结果。在手术的这一部分中，将使用活检冲头来标记Descemet的膜将被剥离的四毫米伤口区域。使用无菌镊子，从培养基中取出角膜，并用1X PBS冲洗以除去残留的培养基和细胞碎片。
冲洗后，将角膜内皮面朝上放在培养皿的盖子上。将新的四毫米活检冲头浸入台盼蓝中的焊盘中，然后轻拍掉多余的。用双手将冲头放在角膜中心上方，并将其直接向下降低到内皮表面，施加最小的压力。
在不改变角膜上的位置或压力的情况下，将拳头转移到一只手上，并用新释放的手伸手抓住镊子。使用镊子将角膜固定到位，同时轻轻地来回扭动活检拳约90度。将活检拳击从角膜上直接抬起并放在一边。
在1X PBS中再次冲洗，以去除多余的台盼蓝。将培养皿盖上的角膜转移到解剖范围内。用弯曲的镊子将角膜固定到位，沿着活检拳留下的台盼蓝环轻轻拖动尖锐的30号针尖，将Descemet的膜划伤。
使用最小的压力，以避免破坏潜在的基质。使用sinskey钩，使用轻柔的舀取动作来提升和剥离Descemet在伤口边缘周围的膜。向病变中心工作。
Descemet的膜应该几乎没有阻力。如果您遇到困难，您可能会拉起基质。如果发生这种情况，请重新开始，从伤口边缘的新点抬起。
一旦Descemet的大部分膜与基质分离，使用Gorovoy镊子去除膜并放在一边。检查剥离区域是否有任何剩余的膜片，并用Gorovoy镊子去除。在Descemet剥离后，用台盼蓝染色角膜，以可视化伤口区域。
在含有0.01%氯化钙和氯化镁的1X PBS中冲洗角膜，以去除可能与台盼蓝相互作用的细胞碎片，并促进其余CEC紧密粘附在完整的Descemet膜上。将角膜放入焊接的培养皿中，并将30微升台盼蓝移液到内皮层上30秒。使用镊子轻轻摇晃角膜，以确保整个内皮表面被覆盖。
用钙和镁冲洗PDS中多余的台盼蓝，并在解剖显微镜下对染色的角膜进行零日时间点成像。该过程完成后，在含有由以下列出的组分组成的低血清培养基的六孔板中培养角膜。在八个仅用低血清培养基的碾磨中培养左角膜，在补充有工程FGF-1或其他所需测试处理的低血清培养基中培养右角膜。
将角膜在37摄氏度和6%CO 2下孵育14天，每日更换培养基。在几天，第三天，第六天，第九天，第12天和第14天重复台盼表染色程序，并在染色后立即对每个角膜进行成像。确保在所有时间点保持相机设置一致。
在培养期之后，可以根据研究兴趣，特别是实验，在角膜上进行额外的染色。与我们实验室研究兴趣相关的其他染色剂包括茜素染色，以及用于EDU掺入和ZO-1紧密连接蛋白的荧光染色。进行茜素染色以可视化细胞边界以确认台盼染色结果并可视化愈合区域的细胞形态。
ZO-1免疫荧光染色可以可视化CEC之间的紧密连接形成，这在愈合区域及其周围特别重要。EdU标记作为定性措施进行，以确认增殖有助于愈合，并且在某些情况下也可用于量化增殖细胞。有关如何执行这些特定染色程序的更详细说明，请参阅与本视频相对应的文章中。
以下是一对被Eye-Bank判定为营养不良的角膜的代表性图像，这些角膜在14天内用或不用工程FGF-1孵育。如图像所示，与未经治疗的对照角膜相比，工程FGF-1处理的角膜显示出加速愈合。在培养期结束时进行额外的茜素染色，用于描绘细胞边界并证实这些发现。
该观察结果在11对营养不良性角膜中复制，以在与临床DSO程序最相关的角膜样本中验证该模型。图像处理软件，如ImageJ，可用于测量这些图像中的染色区域，以量化伤口愈合过程，如图所示。与未经治疗的配偶相比，所有用工程FGF-1治疗的营养不良性角膜在第14天显示出更大的愈合，导致平均91%的愈合，而对照角膜为38%。
这种差异在统计学上是显著的。通过共聚焦成像可视化的其他免疫组化揭示了ZO-1紧密连接蛋白的半组织表达，反映了先前的茜素染色模式。EDU标记证实了伤口区域及其周围存在增殖细胞，并且与未经处理的对照组相比，在治疗的角膜中可见更高的水平。
在一些角膜对中，CEC 死亡可能是伤口区域的外周可见的，特别是在营养不良性角膜中。以下是台盼染色角膜的示例图像，表现出实质性的外周细胞死亡。如图像所示，外周细胞死亡主要发生在较早的时间点，并在培养期间逐渐逆转。
当伤口连接到伤口时，这种外周染色会使伤口区域的定量复杂化，因为很难确定伤口区域边缘的位置。然而，在所有情况下，外周台盼染色足够清晰，可以在最后一天14个时间点产生可测量的图像。我们认为这种现象是供体角膜在体外培养所独有的，与人体内角膜无关。
据我们所知，由于外周内皮的损伤尚未在任何DSO临床案例研究中报道。在茜素红图像中捕获了第二种称为远外围染色的染色图案，但在整个培养期间在台盼蓝图像中也很明显。该观察的特征在于边缘周围有一圈深色染色，表明内皮受损。
尽管有这个术语，但这种模式在正常和营养不良的角膜中都很常见，以至于它们不被算作外周染色阳性。该协议使我们能够在Descemet剥离后用工程FGF-1处理的培养角膜中证明改善愈合效果。此外，对于其他研究DSO的研究人员来说，这种剥离方案是一种有价值的方法，可用于各种应用，包括测试其他伤口愈合疗法，评估对手术技术的修改，以及比较不同供体群体或疾病阶段的愈合。
我们希望这项研究和使用该协议的其他研究鼓励临床医生将来将DSO视为合格FECD患者的宝贵治疗选择。
