Der Zweck dieses Videos ist es, ein menschliches Hornhautorgankulturmodell von Descemets Stripping Only mit beschleunigter Heilung zu beschreiben, das durch den künstlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor eins stimuliert wird. Die Fuch-Endothelial-Hornhautdystrophie (FECD) ist eine Erkrankung, die durch einen Verlust der Pumpfunktion in Hornhautendothelzellen und den übermäßigen Aufbau von Kollagen und anderen extrazellulären Matrixproteinen auf der Oberfläche der Descemet-Membran gekennzeichnet ist und Hornhautgutta bildet. Die einzige bekannte Behandlung für FECD ist die endotheliale Keratoplastik in verschiedenen Formen, die alle mit dem Risiko einer Abstoßung und des Verlusts von Endothelzellen verbunden sind.
Während Fortschritte in der Augenchirurgie es diesen Verfahren ermöglicht haben, im Laufe der Zeit weniger invasiv zu werden, birgt jede Form der Transplantation das Risiko einer Abstoßung und die Möglichkeit einer lebenslangen Verwendung von Steroiden. Descemet's Stripping Only, oder DSO, ist eine experimentelle Alternative, bei der FECD-Patienten mit Guttae, die in der Mitte der Hornhaut lokalisiert sind, den zentralen Vier-Millimeter-Kreis der Descemet-Membran ohne Transplantatersatz entfernen lassen. Die Entfernung von Gutta ermutigt gesunde periphere Zellen, nach innen zu wandern und die endotheliale Monoschicht zu reformieren, wodurch das Stromaödem schließlich umgekehrt und das Sehvermögen verbessert wird.
Obwohl es viele Vorteile für diese Methode gibt, ist der Heilungsprozess langwierig und inkonsistent, und einige Patienten benötigen eine Rettungstransplantation, wenn im Monat nach der Operation keine Heilung beobachtet wird. Eine Behandlung, die eine schnellere Wundheilung nach DSO stimuliert, kann das Verfahren für Patienten mit FECD zu einer praktikableren Option machen. Dieses Protokoll modelliert das klinische DSO-Verfahren in einem Organkulturformat unter Verwendung menschlicher Spenderhornhäute, mit dem Ziel, Behandlungen zur Verbesserung der Wundheilung nach DSO zu testen, um DSO zu einer praktikableren Option für Patienten mit FECD zu machen.
Unser Labor verwendet dieses Modell, um die Wundheilung in Hornhäuten zu testen, die mit einem künstlichen Fibroblastenwachstumsfaktor behandelt wurden, für den wir später in diesem Video repräsentative Ergebnisse zeigen werden. In diesem Teil des Verfahrens wird ein Biopsiestempel verwendet, um die vier Millimeter große Wundfläche zu markieren, von der Descemets Membran entfernt wird. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette die Hornhaut aus dem Medium und spülen Sie sie in 1X PBS ab, um Restmedien und Zellablagerungen zu entfernen.
Nach dem Spülen die Hornhaut-Endothelseite nach oben auf den Deckel einer Petrischale legen. Tauchen Sie einen neuen vier Millimeter Biopsiestempel in Trypanblau in eine Schweißschale und tippen Sie überschüssige Schüssel ab. Positionieren Sie den Schlag mit beiden Händen über der Mitte der Hornhaut und senken Sie ihn mit minimalem Druck gerade auf die Endotheloberfläche.
Ohne die Position oder den Druck auf die Hornhaut zu verändern, verschieben Sie den Schlag auf eine Hand und greifen Sie mit der neu freien Hand nach einer Pinzette. Verwenden Sie die Pinzette, um die Hornhaut an Ort und Stelle zu halten, während Sie den Biopsieschlag mehrmals um etwa 90 Grad hin und her drehen. Heben Sie den Biopsie-Schlag gerade von der Hornhaut an und legen Sie ihn beiseite.
Spülen Sie noch einmal in 1X PBS, um überschüssiges Trypanblau zu entfernen. Hornhaut auf Petrischalendeckel in ein Sezierfernrohr überführen. Wenn Sie die Hornhaut mit einer gekrümmten Pinzette an Ort und Stelle halten, erzielen Sie die Membran von Descemet, indem Sie die Spitze einer scharfen 30-Gauge-Nadel leicht entlang des Rings aus Trypanblau ziehen, der vom Biopsie-Punch hinterlassen wurde.
Verwenden Sie minimalen Druck, um zu vermeiden, dass das darunter liegende Stroma gestört wird. Verwenden Sie mit einem Sinskey-Haken sanfte Schöpfbewegungen, um die Membran von Descemet um den Wundrand herum anzuheben und abzuschälen. Arbeiten Sie in Richtung des Zentrums der Läsion.
Die Membran von Descemet sollte mit sehr wenig Widerstand aufwarten. Wenn Sie Schwierigkeiten haben, ziehen Sie wahrscheinlich Stroma hoch. Wenn dies geschieht, beginnen Sie erneut und heben Sie von einem neuen Punkt entlang der Wundkante an.
Sobald der Großteil der Descemet-Membran vom Stroma getrennt wurde, verwenden Sie eine Gorovoy-Pinzette, um die Membran zu entfernen und beiseite zu legen. Untersuchen Sie den abgestreiften Bereich auf verbleibende Membranstücke und entfernen Sie sie mit einer Gorovoy-Pinzette. Nach Descemets Stripping färben Sie die Hornhaut mit Trypanblau, um den Wundbereich sichtbar zu machen.
Spülen Sie die Hornhaut in 1X PBS, das 0,01% Calciumchlorid und Magnesiumchlorid enthält, um Zellablagerungen zu entfernen, die mit Trypanblau interagieren könnten, und erleichtern Sie die enge Haftung der verbleibenden CECs an der intakten Descemet-Membran. Legen Sie die Hornhaut in eine geschweißte Schale und pipettieren Sie 30 Mikroliter Trypanblau für 30 Sekunden auf die Endothelschicht. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Hornhaut sanft zu schaukeln, um sicherzustellen, dass die gesamte Endotheloberfläche bedeckt ist.
Spülen Sie überschüssiges Trypanblau in PDS mit Kalzium und Magnesium ab und stellen Sie sich die gefärbte Hornhaut unter einem Seziermikroskop für den Tagesnullzeitpunkt vor. Nach Abschluss dieses Verfahrens werden Hornhäute in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit serumarmen Medien gezüchtet, die aus den folgenden aufgeführten Komponenten besteht. Kultur der linken Hornhaut allein in acht Mühlen von Medien mit niedrigem Serumgehalt und die rechte Hornhaut in Medien mit niedrigem Serumgehalt, ergänzt durch technische FGF-1 oder andere gewünschte Testbehandlungen.
Inkubieren Sie die Hornhäute bei 37 Grad Celsius mit 6% CO2 für 14 Tage mit täglichem Medienwechsel. Wiederholen Sie den Trypan-Färbevorgang an Tagen, drei, sechs, neun, 12 und 14, und stellen Sie jede Hornhaut unmittelbar nach dem Färben ab. Achten Sie darauf, dass die Kameraeinstellungen über alle Zeitpunkte hinweg konsistent bleiben.
Nach der Kulturperiode können zusätzliche Flecken auf den Hornhäuten basierend auf Forschungsinteressen, insbesondere für das Experiment, durchgeführt werden. Weitere Flecken, die für die Forschungsinteressen unseres Labors relevant sind, umfassen die Alizarin-Färbung sowie die Fluoreszenzfärbung für die EDU-Inkorporation und ZO-1-Tight-Junction-Proteine. Die Alizarin-Färbung wird durchgeführt, um Zellgrenzen zu visualisieren, um die Ergebnisse der Trypan-Färbung zu bestätigen und die Zellmorphologie im geheilten Bereich zu visualisieren.
Die ZO-1-Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht die Visualisierung der Tight-Junction-Bildung zwischen CECs, was in und um den geheilten Bereich von besonderem Interesse ist. Die EdU-Markierung wird als qualitatives Maß durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Proliferation zur Heilung beiträgt, und kann in einigen Kontexten auch zur Quantifizierung proliferierender Zellen verwendet werden. Ausführlichere Anweisungen zum Ausführen dieser spezifischen Färbevorgänge finden Sie in dem Artikel, der diesem Video entspricht.
Hier sind repräsentative Bilder eines Paares von Hornhäuten, die von der Augenbank als dystrophisch eingestuft wurden und mit oder ohne die technische FGF-1 über einen Zeitraum von 14 Tagen inkubiert wurden. Wie auf den Bildern zu sehen ist, zeigte die mit FGF-1 behandelte Hornhaut eine beschleunigte Heilung im Vergleich zur unbehandelten Kontrollhornhaut. Zusätzliche Alizarin-Färbungen am Ende der Kulturperiode dienten der Abgrenzung der Zellgrenzen und bestätigten diese Befunde.
Diese Beobachtung wurde über 11 Paare dystrophischer Hornhäute repliziert, um das Modell in einer Stichprobe der für das klinische DSO-Verfahren relevantesten Hornhaut zu validieren. Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ kann verwendet werden, um den gefärbten Bereich in diesen Bildern zu messen, um den Fortschritt der Wundheilung zu quantifizieren, wie hier zu sehen ist. Alle dystrophischen Hornhäute, die mit technisch hergestelltem FGF-1 behandelt wurden, zeigten am 14. Tag eine größere Heilung im Vergleich zum unbehandelten Partner, was zu einer durchschnittlichen Heilung von 91% führte, im Gegensatz zu 38% bei Kontrollhornhäuten.
Und dieser Unterschied war statistisch signifikant. Zusätzliche Immunhistochemie, die durch konfokale Bildgebung sichtbar gemacht wurde, zeigte eine halborganisierte Expression des ZO-1-Tight-Junction-Proteins, die frühere Alizarin-Färbemuster widerspiegelt. Die EDU-Markierung bestätigte das Vorhandensein von proliferierenden Zellen im und um den Wundbereich und war in höheren Konzentrationen in behandelten Hornhäuten im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen sichtbar.
Bei einigen Hornhautpaaren kann der CEC-Tod peripher zum Wundbereich sichtbar sein, insbesondere bei dystrophischen Hornhäuten. Hier sind Beispielbilder von Trypan-gefärbten Hornhäuten, die einen erheblichen peripheren Zelltod aufweisen. Wie auf den Bildern zu sehen ist, tritt der periphere Zelltod hauptsächlich zu früheren Zeitpunkten auf und kehrt sich im Laufe der Kulturperiode allmählich um.
Diese periphere Färbung kann die Quantifizierung des Wundbereichs erschweren, wenn er mit der Wunde verbunden ist, da es schwierig sein kann, die Position der Wundbereichskante zu bestimmen. In allen Fällen hat sich die periphere Trypan-Färbung jedoch so weit entfernt, dass am letzten Tag 14 messbare Bilder erzeugt werden konnten. Wir glauben, dass dieses Phänomen einzigartig für Spenderhornhäute ist, die ex vivo kultiviert werden, und für menschliche Hornhäute in vivo nicht relevant ist.
Denn eine Schädigung des peripheren Endothels wurde unseres Wissens in keiner klinischen Fallstudie von DSO berichtet. Ein zweites Färbemuster, das als weit periphere Färbung bezeichnet wird, wurde in den Alizarin Red-Bildern erfasst, war aber auch in Trypan-Blaubildern während der gesamten Kulturperiode sichtbar. Diese Beobachtung ist durch einen Ring dunkler Färbung um den Limbus gekennzeichnet, der auf ein kompromittiertes Endothel hinweist.
Trotz des Begriffs war dieses Muster sowohl bei normalen als auch bei dystrophischen Hornhäuten so häufig, dass sie nicht als positiv für die periphere Färbung gezählt wurden. Dieses Protokoll ermöglichte es uns, verbesserte Heilungsergebnisse bei kultivierten Hornhäuten nachzuweisen, die nach dem Stripping von Descemet mit FGF-1 behandelt wurden. Darüber hinaus dient dieses Stripping-Protokoll als wertvolle Methode für andere Forscher, die DSO untersuchen, und kann für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Prüfung anderer Wundheilungstherapien, der Bewertung von Modifikationen der Operationstechnik und des Vergleichs der Heilung über verschiedene Spenderpopulationen oder Krankheitsstadien hinweg.
Wir hoffen, dass diese Forschung und andere Forschungen, die dieses Protokoll verwenden, Kliniker ermutigen, DSO in Zukunft als wertvolle Behandlungsoption für ihre berechtigten FECD-Patienten in Betracht zu ziehen.
