创面愈合研究的前活体角膜器官培养模型

本文介绍了一种在三维多细胞器官培养模型系统中进行损伤测定的简单方法。我们用猪眼来做，但即使你不熟悉眼睛，你也可以做这种检测。作为概述，我们收到了猪眼，切出地球，在角膜做一个圆形伤口，通过上皮和约三分之一的频闪。

我们切掉角膜，把它安装在Agar底座上，把这个结构放在孵化器里。组织将填补在角膜中留下疤痕。你不需要添加任何生长因子，甚至血清。

这是在无血清介质中完成的。虽然这是在角膜中进行的，但它一般可用作纤维愈合的模型系统。由于许多在疤痕期间激活的细胞通路在系统之间是相似的。

在生物安全罩中，使用直刃手术刀片将地球从乙醇清洁的切碎板上的盖子上取下，并去除每只眼睛多余的脂肪组织。用钳子将清洁的地球后侧立即将眼睛浸入 PBS 中，随后在 10% 碘中快速浸下三次，在 PBS 中快速浸下两次。然后用干净的实验室组织将眼睛绕周包裹起来，用足够的压力包裹，以达到绷紧的角膜表面，而无需接触角膜。

使用六毫米的颤数，穿透角膜中心前频闪的上皮，而不使整个角膜有全厚度伤口，顺时针和逆时针旋转 180 度，同时施加轻压以加深伤口。当伤口足够深，允许用钳子提起组织皮瓣时，使用手术刀片切割与地球平行的皮瓣，同时继续抬起伤口边缘内的前角膜。拆下整个皮瓣后，角膜中心应有圆形伤口。

收获角膜抓住眼睛与实验室组织，并使用手术刀片，使一个小切口一毫米远的角膜的边缘，包括肢体和组织收集。使用小而锋利的剪刀继续切口遍至全球，在角膜上保持一毫米的边距，以保持肢体的机智。然后将角膜，伤口侧向下，在60毫米，或100毫米的菜包含一毫升PBS。

要安装角膜，请使用两对钳子将角膜上皮面向上握住以创建一个杯子，并使用无菌转移移液器将加热的阿加溶液添加到角膜中，直到杯子充满。在阿加硬化后，小心地将角膜放在新的60毫米板或方下，用盖子盖住盘子。然后在每盘角膜上加入四毫升补充无血清介质，在细胞培养培养箱中，在 37 摄氏度的细胞培养箱中保持角膜的气液界面，在 5%的二氧化碳中，每天用一滴从培养皿中的调节介质中补充的无血清介质润湿角膜表面，以保持组织水分。

对于基因敲落，将5微升小干扰或siRNa与50微升的降低血清最小必需介质和2微升转染试剂混合。每角膜有50微升的血清介质。五分钟后，将两种混合物混合在一起，并在每个 siRNA 混合物中加入 200 微升的降低血清最小介质。

然后移液器 siRNA 溶液明智地滴到每个伤口上。然后把角膜放进孵化器里。三个小时后，使用每道菜的培养皿从角膜表面清洗siRNA，用新鲜补充的血清自由介质加抗生素代替每道菜中的调节介质。

然后将角膜培养物返回到细胞培养箱，孵育两周。受伤6小时后，角膜上皮不存在。受伤六天后，上皮重新生长。

荧光氨基染色与阿尔法平滑肌肉作用，揭示了活动肌纤维细胞的梯度沿伤口边缘从前到后频闪。阿尔法平滑肌肉作用素的免疫组织化学染色显示，在受伤加上控制siRNA角膜的α平滑肌肉作用素蛋白表达显著增加。相比未松和目标蛋白siRNA治疗，受伤的角膜。

同样，与未编织的和目标蛋白siRNA治疗的受伤角膜相比，纤维素额外域A在siRNA治疗的受伤角膜中得到调节。证明成功击倒目标蛋白。此外，用非特异性靶向目标蛋白的毒素治疗受伤的角膜可防止再上皮化，导致质量细胞死亡、无组织基质和频闪真空，表明毒素在测定浓度时不会促进愈合。

总之，在尝试此过程时，重要的是记住在切割时保持刀片与组织平行，以便它不会穿透地球。这种检测可以使用不同的伤害技术，包括化学烧伤或上皮刮伤。它也可用于药物毒性测定，以确定上皮是否愈合，以什么速度。

这是一个节省成本的体外，器官培养模型系统，可以先于你的体内伤口愈合研究。