同步干涉反射和全内反射荧光显微镜，用于动态微管和相关蛋白质的成像

这种方法的意义在于，它允许无标记的微管以高帧速率与荧光标记的蛋白质同时成像。该技术的主要优点是易于实施，对光学元件的要求最低。它还规避了微管的氟-4标记需求。

首先，通过将固化剂和基弹性体以1：10的质量比组合来制备PDMS聚合物。将它们混合两分钟，然后在真空室中对混合物进行脱气，直到所有气泡消失。之后，将混合物倒入主模具上约0.5厘米厚的一层，注意避免产生气泡，并将混合物在70摄氏度的预热烤箱中烘烤40分钟。

然后，使用PDMS打孔机切出聚合物的结构区域并在通道的两端打孔。稍后，清洁 PDMS 块的结构侧。随后，用异丙醇和甲醇冲洗三次，然后用超纯水冲洗三次，吹干表面。

接下来，使用氧气或空气等离子体等离子体清洁PDMS，并将等离子体清洁的PDMS放在适当清洁的盖板上。在80摄氏度的热板上加热15分钟。将适当尺寸的低密度聚乙烯管插入孔中，并将出口管连接到0.5毫升注射器。

然后，通过将入口管浸入溶液中并用注射器拉出所需的体积，将溶液流入微通道。将样品放在显微镜载物台上，然后打开落射照明光源进行IRM成像。要聚焦显微镜，请在PDMS解决方案界面附近寻找正确的焦平面，并在通道中心附近选择一个视场。

接下来，在BRB80中制备0.1微摩尔荧光微珠溶液，并在至少一个通道体积的微珠溶液中流动。通过 IRM 或 TIRF 监控反应。当达到所需的微珠密度时，用BRB80洗掉多余的微珠。

将稀释的种子流入反应室并通过IRM监测反应。当达到所需的种子密度时，用BRB80洗掉多余的种子。接下来，在BRB80缓冲液中制备含有12微摩尔未标记微管蛋白，1毫摩尔GTP，5毫摩尔DTT的微管延伸混合物。

然后，在至少一个通道体积的延伸混合物中流动，同时保证反应温度为28摄氏度。首先，在显微镜软件上设置成像设置。开始成像并将驱动蛋白溶液流入腔室。

然后，可视化GFP标记的驱动蛋白1解压微管。测量完成后，录制一个短视频，其中载物台以圆形或横向运动缓慢平移。此视频的中位数投影将用作背景图像，并将从原始测量值中减去。

通过单击图像，从背景记录在ImageJ中创建中位数投影。然后，选择选项 堆栈 并单击 Z 项目。接下来，通过单击“处理”从原始图像数据中减去中位数背景投影，然后选择选项“图像计算器”，同时确保选中 32 位浮点数结果选项。

对于图像配准，选择感兴趣的微管附近的微珠集合，并使用它们来对齐TIRF和IRM图像。对于此集合中的每个磁珠，使用多点选择工具标记 TIRF 通道中的近似位置，然后在 IRM 通道中标记相应的位置。然后，运行提供的 ImageJ 宏。

微珠在右侧的 IRM 通道中显示为黑点，在左侧的 TIRF 通道中显示为亮点。对齐过程通过定位选定的磁珠来正确覆盖两个通道。使用该协议还获得了EGFP标记的驱动蛋白分子向微管收缩末端移动的kymograph。

在执行此过程时，选择高数值孔径物镜非常重要，以实现全内反射，并最大限度地提高收集效率和图像对比度。该方法可用于在大分子结构内同时对单个荧光分子进行高分辨率成像，这些大分子结构的质量足以被IRM可视化，例如细胞膜或肌动蛋白丝。该协议还提供了一种易于调整的程序，可同时进行 IRM、TIRF 和落射荧光的成像。