O significado deste método é que ele permite microtúbulos livres de rótulos para a imagem simultaneamente com proteínas fluorescentes rotuladas a altas taxas de quadros. A principal vantagem dessa técnica é sua fácil implementação e demandas mínimas em componentes ópticos. Também contorna a necessidade de rotulagem fluoro-4 de microtúbulos.
Para começar, prepare o polímero PDMS combinando o agente de cura e o elastômero base em uma relação de massa de 1:10. Misture-os por dois minutos e, em seguida, desgas a mistura em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas desapareçam. Depois, despeje a mistura sobre o molde mestre em uma camada de aproximadamente 0,5 centímetros de espessura, tomando cuidado para evitar criar bolhas, e asse a mistura em um forno pré-aquecido a 70 graus Celsius por 40 minutos.
Em seguida, corte as regiões estruturadas do polímero e faça furos em cada extremidade do canal usando um perfurador PDMS. Mais tarde, limpe o lado estruturado do bloco PDMS. Posteriormente, enxágue três vezes com isopropanol e metanol seguido de água ultrauso e seque a superfície.
Em seguida, o plasma limpe o PDMS usando oxigênio ou plasma de ar e coloque o PDMS limpo de plasma em um vidro de cobertura apropriadamente limpo. Aqueça-o a 80 graus Celsius por 15 minutos. Insira tubos de polietileno de baixa densidade apropriadamente dimensionados nos orifícios e conecte a tubulação de saída a uma seringa de 0,5 mililitro.
Em seguida, flua as soluções para os microcanais imergindo o tubo de entrada na solução e desenhando o volume necessário com a seringa. Coloque a amostra no estágio do microscópio e ligue a fonte de luz epi-iluminação para imagens IRM. Para focar o microscópio, procure o plano focal correto perto da interface de solução PDMS e escolha um campo de visão perto do centro do canal.
Em seguida, prepare a solução 0.1-micromolar de microesferas fluorescentes no BRB80 e flua em pelo menos um volume de canal da solução de microesferas. Monitore a reação via IRM ou TIRF. Quando a densidade desejada de microesferas for alcançada, lave o excesso com BRB80.
Flua sementes diluídas na câmara de reação e monitore a reação através do IRM. Quando a densidade desejada de sementes for alcançada, lave o excesso com BRB80. Em seguida, prepare uma mistura de extensão de microtúbulo contendo tubulina não rotulada de 12 micromolar, GTP de um mililitro, DTT de cinco mililitros no buffer BRB80.
Em seguida, flua em pelo menos um volume de canal da mistura de extensão, garantindo que a temperatura de reação seja de 28 graus Celsius. Para começar, defina as configurações de imagem no software do microscópio. Inicie a imagem e flua a solução de cinesina para a câmara.
Em seguida, visualize os microtúbulos rotulados GFP kinesin 1. Após a medição ser concluída, grave um pequeno vídeo no qual o estágio é lentamente traduzido em um movimento circular ou lateral. A projeção mediana deste vídeo servirá como uma imagem de fundo e será subtraída das medições brutas.
Crie uma projeção mediana no ImageJ a partir da gravação de fundo clicando em Imagem. Em seguida, selecione a opção Stacks e clique em Projeto Z. Em seguida, subtraia a projeção de fundo mediana dos dados de imagem bruta clicando em Process e, em seguida, selecione a opção Calculadora de Imagem, garantindo verificar a opção de resultado flutuante de 32 bits.
Para registro de imagens, escolha uma coleção de microesferas perto do microtúbulo de interesse e use-as para alinhar as imagens TIRF e IRM. Para cada conta desta coleção, use a ferramenta de seleção de vários pontos para marcar a localização aproximada no canal TIRF e, em seguida, a localização correspondente no canal IRM. Em seguida, execute a macro ImageJ fornecida.
Microesferas aparecem como manchas escuras no canal IRM à direita e como pontos brilhantes no canal TIRF à esquerda. O procedimento de alinhamento sobrepõe corretamente os dois canais localizando uma seleção de contas. Um kymograph de moléculas de cinesina rotuladas por EGFP caminhando em direção às extremidades de encolhimento de microtúbulos também foi obtido usando este protocolo.
Ao realizar esse procedimento, é importante escolher objetivos de abertura numérica elevada para alcançar a reflexão interna total e também maximizar a eficiência da coleção e o contraste de imagem. Este método pode ser usado para imagens de alta resolução de moléculas fluorescentes únicas simultaneamente dentro da estrutura macromolecular massiva o suficiente para ser visualizada pelo IRM, como membrana celular ou filamento de actina. Este protocolo também fornece um procedimento facilmente adaptável para imagens simultâneas com qualquer combinação de IRM, TIRF e epifluorescência.
