Значение этого метода заключается в том, что он позволяет микротрубочкам без меток получать изображения одновременно с флуоресцентно мечеными белками с высокой частотой кадров. Основным преимуществом данной методики является ее простота реализации и минимальные требования к оптическим компонентам. Это также обходит необходимость маркировки микротрубочек фтор-4.
Для начала подготовьте полимер PDMS путем объединения отверждающего агента и базового эластомера в массовом соотношении 1:10. Перемешайте их в течение двух минут, а затем дегазируйте смесь в вакуумной камере, пока все пузырьки не исчезнут. После этого вылейте смесь на основную форму слоем толщиной около 0,5 сантиметра, стараясь избегать образования пузырьков, и выпекайте смесь в предварительно разогретой духовке при 70 градусах Цельсия в течение 40 минут.
Затем вырежьте структурированные области полимера и пробивайте отверстия на каждом конце канала с помощью перфоратора PDMS. Затем очистите структурированную сторону блока PDMS. Затем трижды промыть изопропанолом и метанолом, а затем ультрачистой водой и высушить поверхность феном.
Затем плазменно очищают PDMS с использованием кислорода или воздушной плазмы и помещают очищенную плазмой PDMS на соответствующим образом очищенное покровное стекло. Нагрейте его горячей плитой при 80 градусах Цельсия в течение 15 минут. Вставьте полиэтиленовые трубки низкой плотности соответствующего размера в отверстия и подключите выпускную трубку к шприцу объемом 0,5 миллилитра.
Затем перетекают растворы в микроканалы, погружая впускную трубку в раствор и рисуя необходимый объем шприцем. Поместите образец на ступень микроскопа и включите источник света эпиосвещения для визуализации IRM. Чтобы сфокусировать микроскоп, найдите правильную фокальную плоскость рядом с интерфейсом решения PDMS и выберите поле зрения вблизи центра канала.
Далее готовят 0,1-микромолярный раствор флуоресцентных микрошариков в BRB80 и текут по меньшей мере в одном канале объема раствора микрогранул. Контролируйте реакцию с помощью IRM или TIRF. Когда желаемая плотность микрогранул достигнута, вымойте излишки BRB80.
Подавайте разбавленные семена в реакционную камеру и контролируйте реакцию через IRM. Когда желаемая плотность семян будет достигнута, вымойте излишки BRB80. Далее готовят смесь для расширения микротрубочек, содержащую 12-микромолярный немаркированный тубулин, одномиллимолярный ГТФ, пятимиллимолярный DTT в буфере BRB80.
Затем протойте по меньшей мере в одном канале объема удлинительной смеси, гарантируя, что температура реакции составляет 28 градусов Цельсия. Для начала установите параметры визуализации в программном обеспечении микроскопа. Запустите визуализацию и перетейте раствор кинезина в камеру.
Затем визуализируйте GFP меченые кинезином 1, размазывающие микротрубочки. После завершения измерения запишите короткое видео, в котором этап медленно переводится в круговом или боковом движении. Медианная проекция этого видео будет служить фоновым изображением и будет вычитаться из необработанных измерений.
Создайте медианную проекцию в ImageJ из фоновой записи, нажав на Изображение. Затем выберите опцию Стеки и нажмите на Z Project. Затем вычтите медианную фоновую проекцию из необработанных данных изображения, нажав «Обработать», а затем выберите опцию «Калькулятор изображений», проверив параметр 32-разрядного плавающего результата.
Для регистрации изображений выберите коллекцию микрошариков рядом с интересующей микротрубочкой и используйте их для выравнивания изображений TIRF и IRM. Для каждой бусины в этой коллекции используйте инструмент многоточечного выбора, чтобы отметить приблизительное местоположение в канале TIRF, а затем соответствующее местоположение в канале IRM. Затем запустите предоставленный макрос ImageJ.
Микрошарики отображаются как темные пятна в канале IRM справа и как яркие пятна в канале TIRF слева. Процедура выравнивания правильно накладывает два канала, локализуя выбор бусин. С помощью этого протокола также был получен кимограф меченых EGFP молекул кинезина, идущих к уменьшающимся концам микротрубочек.
При выполнении этой процедуры важно выбрать цели с высокой числовой диафрагмой, чтобы достичь полного внутреннего отражения, а также максимизировать эффективность сбора и контрастность изображения. Этот метод может быть использован для визуализации с высоким разрешением одиночных флуоресцентных молекул одновременно в макромолекулярной структуре, достаточно массивной, чтобы ее можно было визуализировать с помощью IRM, такой как клеточная мембрана или актиновая нить. Этот протокол также обеспечивает легко адаптируемую процедуру одновременной визуализации с любой комбинацией IRM, TIRF и эпифлуоресценции.
