La importancia de este método es que permite que los microtúbulos libres de etiquetas se muestren simultáneamente con proteínas marcadas fluorescentemente a altas velocidades de fotogramas. La principal ventaja de esta técnica es su fácil implementación y las mínimas exigencias en componentes ópticos. También elude la necesidad de etiquetar con fluoro-4 los microtúbulos.
Para comenzar, prepare el polímero PDMS combinando el agente de curado y el elastómero base en una relación de masa de 1:10. Mézclalos durante dos minutos y luego desgasifica la mezcla en una cámara de vacío hasta que desaparezcan todas las burbujas. Después, vierta la mezcla sobre el molde maestro en una capa de aproximadamente 0,5 centímetros de espesor, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas, y hornee la mezcla en un horno precalentado a 70 grados centígrados durante 40 minutos.
Luego, corte las regiones estructuradas del polímero y perfore agujeros en cada extremo del canal con un perforador PDMS. Más tarde, limpie el lado estructurado del bloque PDMS. Posteriormente, enjuague tres veces con isopropanol y metanol seguido de agua ultrapura y seque la superficie.
A continuación, limpie el PDMS con oxígeno o plasma de aire y coloque el PDMS limpiado con plasma en un vidrio de cubierta limpiado adecuadamente. Calentar una placa caliente a 80 grados centígrados durante 15 minutos. Inserte tubos de polietileno de baja densidad del tamaño adecuado en los orificios y conecte el tubo de salida a una jeringa de 0,5 mililitros.
Luego, fluya las soluciones en los microcanales sumergiendo el tubo de entrada en la solución y extrayendo el volumen requerido con la jeringa. Coloque la muestra en el escenario del microscopio y encienda la fuente de luz de iluminación epi para obtener imágenes IRM. Para enfocar el microscopio, busque el plano focal correcto cerca de la interfaz de la solución PDMS y elija un campo de visión cerca del centro del canal.
A continuación, prepare la solución 0.1-micromolar de microperlas fluorescentes en BRB80 y fluya en al menos un volumen de canal de la solución de microperlas. Monitoree la reacción a través de IRM o TIRF. Cuando se logre la densidad deseada de microperlas, lave el exceso con BRB80.
Fluya las semillas diluidas en la cámara de reacción y monitoree la reacción a través de IRM. Cuando se logre la densidad deseada de semillas, lave el exceso con BRB80. A continuación, prepare una mezcla de extensión de microtúbulos que contenga tubulina sin etiquetar 12 micromolares, GTP de un milimolar, TDT de cinco milimolares en tampón BRB80.
Luego, fluya en al menos un volumen de canal de la mezcla de extensión mientras se asegura de que la temperatura de reacción sea de 28 grados centígrados. Para comenzar, establezca la configuración de imágenes en el software del microscopio. Inicie la toma de imágenes y haga fluir la solución de kinesina a la cámara.
Luego, visualice los microtúbulos de kinesina 1 marcados con GFP. Una vez completada la medición, grabe un video corto en el que el escenario se traduzca lentamente en un movimiento circular o lateral. La proyección mediana de este vídeo servirá como imagen de fondo y se restará de las medidas en bruto.
Cree una proyección mediana en ImageJ a partir de la grabación de fondo haciendo clic en Imagen. Luego, seleccione la opción Pilas y haga clic en Proyecto Z. A continuación, reste la proyección de fondo mediana de los datos de imagen sin procesar haciendo clic en Procesar y luego seleccione la opción Calculadora de imágenes mientras se asegura de verificar la opción de resultado flotante de 32 bits.
Para el registro de imágenes, elija una colección de microperlas cerca del microtúbulo de interés y utilícelas para alinear las imágenes TIRF e IRM. Para cada cuenta de esta colección, utilice la herramienta de selección multipunto para marcar la ubicación aproximada en el canal TIRF y, a continuación, la ubicación correspondiente en el canal IRM. A continuación, ejecute la macro ImageJ proporcionada.
Las microperlas aparecen como manchas oscuras en el canal IRM a la derecha y como puntos brillantes en el canal TIRF a la izquierda. El procedimiento de alineación superpone correctamente los dos canales localizando una selección de cuentas. También se obtuvo un kymograph de moléculas de quinesina marcadas con EGFP que caminan hacia los extremos encogidos de los microtúbulos utilizando este protocolo.
Al realizar este procedimiento, es importante elegir objetivos de alta apertura numérica para lograr una reflexión interna total y también para maximizar la eficiencia de la recolección y el contraste de la imagen. Este método se puede utilizar para imágenes de alta resolución de moléculas fluorescentes individuales simultáneamente dentro de la estructura macromolecular lo suficientemente masiva como para ser visualizada por IRM, como la membrana celular o el filamento de actina. Este protocolo también proporciona un procedimiento fácilmente adaptable para imágenes simultáneas con cualquier combinación de IRM, TIRF y epifluorescencia.
