光诱导 原 位透射电子显微镜观察液-软物质相互作用

该协议介绍了如何使用液体细胞TEM和光照明的组合来观察光照明时用光敏剂封装的细菌的结构变化。这种技术的主要优点是它的简单性。该方案不需要困难的样品制备，并用光敏剂溶液提供足够的细菌包封。

首先，通过将光纤连接到物镜顶部的显微镜柱来修改透射电子显微镜。物镜和聚光镜之间留出几厘米的空间，外加一个用于存放配件的空闲插槽。将两个覆盖有无定形碳的未经处理的TEM网格放在两个交叉的镊子之间，面向顶部的碳涂层面。

使网格尽可能靠近边缘。将四微升细菌溶液放在其中一个网格上。样品的光密度必须在5到10的范围内。

等待60秒，然后使用滤纸小心地吸干液体。在此过程中，尝试将液体散布在整个网格表面。将四微升光敏剂放在同一个网格上。

五秒钟后，吸干液体。在基材上留下一层非常薄的液体。快速将干燥的网格放在覆盖有液体的网格顶部。

轻轻地将上部网格移动到第二个网格的边缘，然后用镊子挤压边缘的基板。小心地重复挤压。将液体细胞放在镊子之间一分钟。

完成制备后立即将样品插入TEM支架。将样品插入显微镜后，以低倍率模式开始观察，以找到合适的观察区域。在观察过程中，保持电子剂量尽可能低。

延长曝光时间。在适当的放大倍率下找到被液体包围的细胞，并延长曝光时间，并立即捕获第一张图像。保持电子剂量恒定，每30秒收集一次图像以观察变化。

仔细检查图像并计算对应于细胞中第一个可见变化的总电子剂量。在开始实验之前，通过调整电流值来设置激光强度。将样品插入显微镜并找到观察区域。

在开始对样品进行照明之前捕获细胞的第一张图像，并使用光束遮蔽器关闭电子束以避免电子辐射的影响。打开激光。从较短的照明时间开始，因为激光具有相对较高的强度。

之后，关闭光源。关闭光束遮光器，并立即捕获图像。如果可能，请使用自动算法仅在拍摄图像所需的时间内曝光样本。

仔细测量电子照射时间以计算用于成像的电子剂量。观察到由一分钟后光敏剂的较轻辐射产生的活性氧引起的细胞外层显着降解。进一步的光照使变化更加明显。

在低放大倍率下很容易找到具有足够液体的适当观察点，因为这些区域看起来更暗和模糊。液体覆盖的细菌比干燥的细菌更不明显，但仍然可以区分。在成像过程中观察液体边界很有用，并且可以轻松检测到其运动，这意味着所选区域可能不合适且不稳定。

观察期间的另一个问题是水的蒸发和溶液的沉淀，这可能发生在样品的随机区域，包括细菌周围的区域。细菌的包封也可以使用石墨烯和硝酸硅膜进行。样品制备比较困难，但液室的稳定性会更好。

所提出的方法可用于观察液体上的光诱导反应。例如，光对金属材料的影响，光诱导的催化剂和光化学反应。