Das Protokoll stellt dar, wie die Kombination von flüssigem Zell-TEM und Lichtbeleuchtung verwendet werden kann, um die strukturellen Veränderungen in den Bakterien zu beobachten, die mit Photosensibilisator bei Lichtbeleuchtung verkapselt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit. Das Protokoll erfordert keine schwierige Probenvorbereitung und bietet eine ausreichende Verkapselung von Bakterien mit Photosensibilisatorlösung.
Um zu beginnen, modifizieren Sie das Transmissionselektronenmikroskop, indem Sie die optische Faser mit der Mikroskopsäule an der Oberseite der Objektivlinse verbinden. Lassen Sie einige Zentimeter Platz zwischen der Objektivlinse und der Kondensatorlinse sowie einen freien Schlitz für Zubehör. Platzieren Sie zwei unbehandelte TEM-Gitter, die mit amorphem Kohlenstoff bedeckt sind, zwischen zwei gekreuzten Pinzetten, die der kohlenstoffbeschichteten Seite nach oben zeigen.
Halten Sie die Gitter so nah wie möglich am Rand. Legen Sie vier Mikroliter Bakterienlösung auf eines der Gitter. Die optische Dichte der Probe muss im Bereich von fünf bis 10 liegen.
Warten Sie 60 Sekunden und tupfen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit Filterpapier ab. Versuchen Sie, die Flüssigkeit während des Prozesses über die gesamte Gitteroberfläche zu verteilen. Legen Sie vier Mikroliter Photosensibilisator auf das gleiche Raster.
Nach fünf Sekunden die Flüssigkeit auslöschen. Lassen Sie eine sehr dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Substrat. Legen Sie den trockenen Rost schnell auf den mit Flüssigkeit bedeckten.
Bewegen Sie das obere Gitter vorsichtig an den Rand des zweiten und drücken Sie die Substrate an den Rändern mit einer Pinzette zusammen. Wiederholen Sie den Druck vorsichtig. Lassen Sie die flüssige Zelle zwischen der Pinzette für eine Minute.
Führen Sie die Probe direkt nach Abschluss der Präparation in den TEM-Halter ein. Nachdem Sie die Probe in das Mikroskop eingeführt haben, starten Sie die Beobachtungen im Modus mit geringer Vergrößerung, um einen geeigneten Beobachtungsbereich zu finden. Halten Sie während der Beobachtungen die Elektronendosis so gering wie möglich.
Verlängern Sie die Belichtungszeit. Finden Sie die von Flüssigkeit umgebenen Zellen in der entsprechenden Vergrößerung mit verlängerter Belichtungszeit und nehmen Sie sofort das erste Bild auf. Halten Sie die Elektronendosis konstant und sammeln Sie alle 30 Sekunden Bilder, um die Veränderungen zu beobachten.
Untersuchen Sie die Bilder sorgfältig und berechnen Sie die Gesamtelektronendosis, die den ersten sichtbaren Veränderungen in den Zellen entspricht. Stellen Sie vor Beginn des Experiments die Laserlichtintensität ein, indem Sie den aktuellen Wert anpassen. Führen Sie die Probe in das Mikroskop ein und finden Sie den Beobachtungsbereich.
Nehmen Sie das erste Bild der Zelle auf, bevor Sie mit der Beleuchtung der Probe beginnen, und verwenden Sie den Strahlblanker, um den Elektronenstrahl auszuschalten, um die Auswirkungen der Elektronenbestrahlung zu vermeiden. Schalten Sie den Laser ein. Beginnen Sie mit einer kurzen Beleuchtungszeit, da das Laserlicht eine relativ hohe Intensität hat.
Schalten Sie nach dieser Zeit die Lichtquelle aus. Schalten Sie den Strahlblanker aus und nehmen Sie das Bild sofort auf. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen automatischen Algorithmus, um die Probe nur für die Zeit verfügbar zu machen, die für die Aufnahme des Bildes benötigt wird.
Messen Sie sorgfältig die Elektronenbestrahlungszeit, um die Elektronendosis zu berechnen, die für die Bildgebung verwendet wird. Es wird ein bemerkenswerter Abbau der äußeren Zellschicht beobachtet, der durch die reaktiven Sauerstoffspezies verursacht wird, die durch leichtere Strahlung des Photosensibilisators nach einer Minute erzeugt werden. Eine weitere Lichtbeleuchtung machte die Veränderungen sichtbarer.
Richtige Beobachtungspunkte mit genügend Flüssigkeit können bei geringer Vergrößerung leicht gefunden werden, da diese Bereiche dunkler und verschwommen erscheinen. Die mit Flüssigkeit bedeckten Bakterien sind weniger sichtbar als die trockenen, können aber dennoch unterschieden werden. Es ist nützlich, die Flüssigkeitsgrenze während der Bildgebung zu betrachten, und ihre Bewegung kann leicht erkannt werden, was bedeutet, dass der gewählte Bereich ungeeignet und instabil sein könnte.
Ein weiteres Problem während der Beobachtungen ist die Verdunstung des Wassers und die Ausfällung der Lösung, die in zufälligen Bereichen der Probe auftreten kann, einschließlich der Bereiche um die Bakterien. Die Verkapselung von Bakterien kann auch mit Graphen- und Siliziumnitratmembranen durchgeführt werden. Die Probenvorbereitung ist schwieriger, aber die Stabilität der flüssigen Zelle wird besser sein.
Die vorgestellte Methode kann zur Beobachtung von lichtinduzierten Reaktionen an Flüssigkeiten verwendet werden. Zum Beispiel der Einfluss von Licht auf metallische Werkstoffe, lichtinduzierte Katalysatoren und photochemische Reaktionen.
