O protocolo apresenta como a combinação de MET de células líquidas e iluminação luminosa pode ser usada para observar as mudanças estruturais nas bactérias encapsuladas com fotossensibilizador sobre a iluminação luminosa. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade. O protocolo não requer preparação difícil da amostra e fornece encapsulamento suficiente de bactérias com solução fotossensibilizadora.
Para começar, modifique o microscópio eletrônico de transmissão conectando a fibra óptica à coluna do microscópio na parte superior da lente objetiva. Permita alguns centímetros de espaço entre a lente objetiva e a lente condensadora, além de um slot livre para acessórios. Coloque duas grades MET não tratadas cobertas com carbono amorfo entre duas pinças cruzadas, voltadas para o lado revestido de carbono até o topo.
Mantenha as grades o mais próximo possível da borda. Coloque quatro microlitros de solução bacteriana em uma das grades. A densidade óptica da amostra deve situar-se entre cinco e 10.
Aguarde 60 segundos e limpe cuidadosamente o líquido usando papel de filtro. Tente espalhar o líquido por toda a superfície da grade durante o processo. Coloque quatro microlitros de fotossensibilizador na mesma grade.
Após cinco segundos, apague o líquido. Deixe uma camada muito fina de líquido sobre o substrato. Coloque rapidamente a grade seca em cima da coberta com líquido.
Mova suavemente a grade superior para a borda da segunda e esprema os substratos nas bordas usando uma pinça. Repita cuidadosamente o aperto. Deixe a célula líquida entre as pinças por um minuto.
Inserir a amostra no suporte TEM logo após o término da preparação. Depois de inserir a amostra no microscópio, inicie as observações no modo de baixa ampliação para encontrar uma área de observação adequada. Durante as observações, mantenha a dose de elétrons o mais baixa possível.
Expanda o tempo de exposição. Encontre as células cercadas por líquido na ampliação apropriada com tempo de exposição prolongado e capture a primeira imagem imediatamente. Mantenha a dose de elétrons constante e colete imagens a cada 30 segundos para observar as mudanças.
Examine cuidadosamente as imagens e calcule a dose total de elétrons que corresponde às primeiras mudanças visíveis nas células. Antes de iniciar o experimento, defina a intensidade da luz laser ajustando o valor atual. Insira a amostra no microscópio e encontre a área de observação.
Capture a primeira imagem da célula antes de iniciar a iluminação da amostra e use o feixe em branco para desligar o feixe de elétrons para evitar os efeitos da irradiação de elétrons. Ligue o laser. Comece com um curto tempo de iluminação, pois a luz do laser tem intensidade relativamente alta.
Após esse tempo, desligue a fonte de luz. Desligue o feixe em branco e capture a imagem imediatamente. Se possível, use um algoritmo automático para expor a amostra apenas pelo tempo necessário para tirar a imagem.
Meça cuidadosamente o tempo de irradiação de elétrons para calcular a dose de elétrons usada para imagens. Observa-se uma notável degradação da camada externa da célula causada pelas espécies reativas de oxigênio geradas pela radiação mais leve do fotossensibilizador após um minuto. Uma maior iluminação de luz tornou as mudanças mais visíveis.
Pontos de observação adequados com líquido suficiente podem ser facilmente encontrados em baixa ampliação, pois essas áreas parecem mais escuras e borradas. As bactérias cobertas de líquido são menos visíveis do que as secas, mas ainda podem ser distinguidas. É útil olhar para o limite do líquido durante a imagem, e seu movimento pode ser facilmente detectado, o que implica que a área escolhida pode ser inadequada e instável.
Outro problema durante as observações é a evaporação da água e a precipitação da solução, que pode ocorrer em áreas aleatórias da amostra, incluindo as áreas ao redor das bactérias. O encapsulamento de bactérias também pode ser realizado usando membranas de grafeno e nitrato de silício. A preparação da amostra é mais difícil, mas a estabilidade da célula líquida será melhor.
O método apresentado pode ser usado para observações de reações induzidas pela luz em líquido. Por exemplo, a influência da luz em materiais metálicos, catalisadores induzidos pela luz e reações fotoquímicas.
