Il protocollo presenta come la combinazione di TEM a celle liquide e illuminazione della luce può essere utilizzata per osservare i cambiamenti strutturali nei batteri incapsulati con fotosensibilizzatore su illuminazione della luce. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità. Il protocollo non richiede una difficile preparazione del campione e fornisce un incapsulamento sufficiente dei batteri con soluzione fotosensibilizzante.
Per iniziare, modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell'obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell'obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori. Posizionare due griglie TEM non trattate ricoperte di carbonio amorfo tra due pinzette incrociate, rivolte verso l'alto verso l'alto.
Tenere le griglie il più vicino possibile al bordo. Metti quattro microlitri di soluzione batterica su una delle griglie. La densità ottica del campione deve essere compresa tra cinque e 10.
Attendere 60 secondi e asciugare accuratamente il liquido con carta da filtro. Cerca di distribuire il liquido su tutta la superficie della griglia durante il processo. Metti quattro microlitri di fotosensibilizzatore sulla stessa griglia.
Dopo cinque secondi, asciugare il liquido. Lasciare uno strato molto sottile di liquido sul substrato. Posizionare rapidamente la griglia asciutta sopra quella coperta di liquido.
Spostare delicatamente la griglia superiore sul bordo della seconda e spremere i substrati ai bordi usando una pinzetta. Ripetere attentamente la compressione. Lasciare la cellula liquida tra le pinzette per un minuto.
Inserire il campione nel supporto TEM subito dopo aver terminato la preparazione. Dopo aver inserito il campione nel microscopio, avviare le osservazioni in modalità a basso ingrandimento per trovare un'area di osservazione adatta. Durante le osservazioni mantenere la dose di elettroni più bassa possibile.
Espandi il tempo di esposizione. Trova le celle circondate da liquido all'ingrandimento appropriato con un tempo di esposizione prolungato e cattura immediatamente la prima immagine. Mantieni costante la dose di elettroni e raccogli immagini ogni 30 secondi per osservare i cambiamenti.
Esaminare attentamente le immagini e calcolare la dose totale di elettroni che corrisponde ai primi cambiamenti visibili nelle cellule. Prima di iniziare l'esperimento, impostare l'intensità della luce laser regolando il valore corrente. Inserire il campione nel microscopio e trovare l'area di osservazione.
Acquisire la prima immagine della cella prima di iniziare l'illuminazione del campione e utilizzare il beam blanker per spegnere il fascio di elettroni per evitare gli effetti dell'irradiazione elettronica. Accendi il laser. Inizia con un breve tempo di illuminazione, poiché la luce laser ha un'intensità relativamente elevata.
Dopo quel tempo, spegnere la fonte di luce. Disattiva il beam blanker e acquisisci immediatamente l'immagine. Se possibile, utilizzare un algoritmo automatico per esporre il campione solo per il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine.
Misurare attentamente il tempo di irradiazione elettronica per calcolare la dose di elettroni utilizzata per l'imaging. Si osserva una notevole degradazione dello strato esterno della cellula causata dalle specie reattive dell'ossigeno generate dalla radiazione più leggera del fotosensibilizzatore dopo un minuto. Un'ulteriore illuminazione luminosa ha reso i cambiamenti più visibili.
Punti di osservazione adeguati con abbastanza liquido possono essere facilmente trovati a basso ingrandimento, poiché queste aree appaiono più scure e sfocate. I batteri coperti di liquido sono meno visibili di quelli secchi, ma possono ancora essere distinti. È utile osservare il confine del liquido durante l'imaging e il suo movimento può essere facilmente rilevato, il che implica che l'area scelta potrebbe essere inadatta e instabile.
Un altro problema durante le osservazioni è l'evaporazione dell'acqua e la precipitazione della soluzione che può verificarsi in aree casuali del campione, comprese le aree circostanti i batteri. L'incapsulamento dei batteri può essere eseguito anche utilizzando membrane di grafene e nitrato di silicio. La preparazione del campione è più difficile, ma la stabilità della cella liquida sarà migliore.
Il metodo presentato può essere utilizzato per osservazioni di reazioni indotte dalla luce su liquido. Ad esempio, l'influenza della luce su materiali metallici, catalizzatori indotti dalla luce e reazioni fotochimiche.
