В протоколе представлено, как комбинация ТЕА жидких клеток и светового освещения может быть использована для наблюдения структурных изменений в бактериях, инкапсулированных фотосенсибилизатором при световом освещении. Главным преимуществом данной методики является ее простота. Протокол не требует сложной пробоподготовки и обеспечивает достаточную инкапсуляцию бактерий раствором фотосенсибилизатора.
Для начала модифицируйте просвечивающий электронный микроскоп, подключив оптическое волокно к колонке микроскопа в верхней части объектива. Оставьте несколько сантиметров пространства между объективом и объективом конденсатора, а также свободный слот для аксессуаров. Поместите две необработанные решетки ТЕА, покрытые аморфным углеродом, между двумя скрещенными пинцетами, обращенными к стороне с углеродным покрытием сверху.
Держите сетки как можно ближе к краю. Нанесите четыре микролитра раствора бактерий на одну из сеток. Оптическая плотность образца должна находиться в диапазоне от пяти до 10.
Подождите 60 секунд и тщательно промойте жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Постарайтесь распределить жидкость по всей поверхности сетки во время процесса. Поместите четыре микролитра фотосенсибилизатора на одну сетку.
Через пять секунд смойте жидкость. Оставьте очень тонкий слой жидкости на подложке. Быстро поместите сухую сетку поверх той, которая покрыта жидкостью.
Аккуратно переместите верхнюю сетку к краю второй, и сожмите подложки по краям с помощью пинцета. Осторожно повторите сжатие. Оставьте жидкую клетку между пинцетом на одну минуту.
Вставьте образец в держатель ТЕА сразу после завершения подготовки. После введения образца в микроскоп начните наблюдения в режиме низкого увеличения, чтобы найти подходящую область наблюдения. Во время наблюдений держите электронную дозу как можно ниже.
Увеличьте время экспозиции. Найдите клетки, окруженные жидкостью, при соответствующем увеличении с увеличенным временем экспозиции и немедленно захватите первое изображение. Держите электронную дозу постоянной и собирайте изображения каждые 30 секунд, чтобы наблюдать за изменениями.
Внимательно изучите изображения и рассчитайте общую дозу электронов, которая соответствует первым видимым изменениям в клетках. Перед началом эксперимента установите интенсивность лазерного света, отрегулировав текущее значение. Вставьте образец в микроскоп и найдите область наблюдения.
Захватите первое изображение ячейки перед началом освещения образца и используйте пучковый гашок, чтобы отключить электронный пучок, чтобы избежать последствий электронного облучения. Включите лазер. Начните с короткого времени освещения, так как лазерный свет имеет относительно высокую интенсивность.
По истечении этого времени выключите источник света. Выключите заглушку луча и немедленно захватите изображение. Если возможно, используйте автоматический алгоритм для предоставления образца только в течение времени, необходимого для получения изображения.
Тщательно измерьте время электронного облучения, чтобы рассчитать дозу электрона, используемую для визуализации. Наблюдается заметная деградация внешнего слоя клетки, вызванная активными формами кислорода, генерируемыми более легким излучением фотосенсибилизатора через одну минуту. Дальнейшее световое освещение сделало изменения более заметными.
Правильные пятна наблюдения с достаточным количеством жидкости можно легко найти при небольшом увеличении, так как эти области кажутся темнее и размытыми. Бактерии, покрытые жидкостью, менее заметны, чем сухие, но их все же можно различить. Полезно смотреть на границу жидкости во время визуализации, и ее движение может быть легко обнаружено, что означает, что выбранная область может быть неподходящей и нестабильной.
Другой проблемой во время наблюдений является испарение воды и осаждение раствора, которые могут происходить в случайных областях образца, включая области, окружающие бактерии. Инкапсуляция бактерий также может быть выполнена с использованием мембран графена и нитрата кремния. Пробоподготовка сложнее, но стабильность жидкой клетки будет лучше.
Представленный способ может быть использован для наблюдений за светоиндуцированными реакциями на жидкость. Например, влияние света на металлические материалы, светоиндуцированные катализаторы и фотохимические реакции.
