从蓝藻中提取非蛋白质氨基酸用于液相色谱-串联质谱分析

该协议将帮助用户并教学生提取BMA，AEG和2，4-DAB的正确步骤。从而最大限度地减少出错的机会并产生一致的结果。该方法是提取桑拿细菌基质中BMA及其异构体AEG和2，4-DAB的常用和验证方法。

该方法可用于进一步研究BMA的毒性，并提供有关BMA及其相关健康影响的更深入的了解。首先将蓝藻样品在3， 500 G下在25摄氏度下离心10分钟。并将上清液丢弃到生物废物中。

用密封膜盖住装有颗粒的离心管，并使用锋利的长鼻镊子在薄膜上刺穿几个孔。然后将管子直立存放在零下 80 摄氏度。30分钟后，将管子直立放入冷冻干燥器玻璃容器中，然后将容器放入零下80摄氏度的冰箱中冷却五分钟。

从冰箱中取出玻璃容器并盖上橡胶盖。确保冷冻干燥机橡胶阀出口上的手柄朝上并排放到大气中。牢固地连接玻璃容器。

慢慢转动橡胶阀出口的手柄，将其指向向下位置，将罐子暴露在真空中。并允许长达 24 小时的冷冻干燥以升华所有液体。完成后，将15至50毫克冷冻样品颗粒称入15毫升离心管中。

使用分析天平。向样品中加入300至600微升10%三氯乙酸水溶液或TCA。将样品管放入装满碎冰的容器中。

在将探头末端完全浸入样品中并按下开始之前，用喷有 70% 乙醇的无绒纸擦拭超声仪探头。完成后，将含有离心管的样品放在冰上一分钟。并重复超声处理过程以确保细胞裂解。

将样品在4摄氏度下冷却24小时后。在 3， 500 G 下在 8 摄氏度下离心 15 分钟。然后使用微量移液管，将上清液转移到标记的游离级分的两毫升管中。

向样品沉淀中加入400微升10%TCA水溶液，并通过涡旋搅拌或微量移液器吸头分解沉淀。离心并将上清液转移到相同的两毫升游离馏分管中。使用10%TCA丙酮第三次重复此步骤。

将盖子打开的自由馏分管放入离心蒸发器中，直到除去所有挥发性液体。一旦样品不含挥发性液体，用天花板膜牢固地覆盖管子，并使用锋利的长鼻镊子用几个孔刺穿薄膜。在前面演示的冷冻干燥后，用200微升20毫摩尔盐酸重新配制样品，并将其置于零下80摄氏度的冰箱中。

使用微量移液管将400微升100%丙酮添加到样品沉淀中，并使用涡旋搅拌或微量移液器尖端分解沉淀。定量地将洗涤和重悬的颗粒转移到相应的玻璃壳小瓶中。使用一毫升微量移液器。

向样品管中再加入400微升丙酮，以帮助转移剩余的沉淀。离心并将上清液倒入生物废物中，然后在离心蒸发器中干燥沉淀，直到液体被除去并且沉淀干燥。为了制备真空水解文件，在水解文件的底部加入一毫升六摩尔盐酸。

使用镊子小心地将带有干燥样品的标记贝壳小瓶插入水解文件中，确保直立稳定的位置。将盖子连接到水解文件，然后推动盖子上的红色旋钮以关闭阀门。打开真空泵后，将真空管连接到水解文件盖的头部，然后按下盖子上的绿色旋钮以打开阀门。

接下来，让真空泵从小瓶中取出空气一分钟。然后通过按下水解瓶盖上的红色旋钮来关闭小瓶。关闭真空泵并拆下真空管。

将橡胶管连接到实验室工作台上的氮气龙头上。并稍微打开水龙头。将拇指放在管子的末端，密封并计数，直到随着压力的增加气体开始逸出。

接下来，将橡胶管的另一端连接到水解瓶盖的头部。并立即推动盖子的绿色旋钮。计算气体逸出所需的时间。

快速推动盖子上的红色旋钮并取下橡胶管。重复整个真空处理过程两次。确保玻璃水解瓶不含空气并充满氮气。

将水解瓶放入预热的烤箱中，设置为110摄氏度16至18小时。使用烤箱手套，从烤箱中取出玻璃水解瓶。让小瓶在通风橱内冷却 10 分钟，然后推动绿色旋钮，同时将其朝外以释放压力和气体。

用200微升20摩尔盐酸将水解样品沉淀复溶到壳瓶中，并重悬沉淀。将含有重组样品沉淀的壳小瓶在5，300G和25摄氏度下离心两分钟。将重组的游离级分样品和蛋白质级分转移到含有0.2微米孔径膜过滤器的两个毫升过滤管中，并标记为游离级分和蛋白质级分。

将试管在5，000G和25摄氏度下离心30分钟。此处显示了含有β-甲氨基-L-丙氨酸或BMAA的标准品及其异构体的多反应监测色谱图，用颜色编码线表示。在从利德尔湖收集的Merismopedia物种的游离部分中观察到所有三种异构体BMAA，DAB和AEG的阳性检测结果。

而从瓦卡水厂收集的微囊藻-水族物种的结合部分表明BMAA及其异构体的结果为阴性。重悬的沉淀必须定量转移到相应的壳小瓶中，以允许基于蓝藻质量的准确归一化点。在执行此步骤时，建议患者和尽职调查。

按照此过程操作。提取的馏分必须经过失活步骤以允许反向相。液相色谱、串联质谱分析。

该技术的应用扩展了各种科学领域。包括通过分析环境样品中的犬类毒素来研究环境科学。以及毒理学和生物化学等领域，通过对BMA误入理论的研究。