基于靶向质谱的低丰度蛋白质蛋白分析中的微量采样

该协议为您提供了有关如何制备用于亲和纯化和蛋白质蛋白水解的磁珠以及如何使用它们测定干燥微量样品中的低丰度蛋白质的分步概述。主要优点是，您可以准备和执行来自非常小体积的复杂样品的高效采样的工具。只要您能够获得有效的抗体来捕获蛋白质或蛋白型肽，该方法就可以适用于其他蛋白质生物标志物。

在调整抗体酸处理的pH值时，您需要非常小心，尤其是在制备少量磁珠时。首先，将所需体积的抗体溶液转移到五毫升低蛋白结合微量离心管中，并向抗体溶液中加入一个小的磁力搅拌棒。使用带微电极的pH计测量pH值，并通过首先加入10微升一摩尔盐酸来调节pH值，然后在pH值接近2.5时减小体积。

记录将pH调节至2.5所需的一摩尔盐酸的总体积。取出微电极，并将酸化抗体在冰上，在磁力搅拌器上孵育一小时。为了中和抗体溶液，测量pH值并将其调节至7，首先加入10微升一摩尔氢氧化钠，然后在pH接近7时减少氢氧化钠的体积。

记录加入的一摩尔氢氧化钠的总体积。在涡旋混合器上彻底混合磁珠悬浮液，并抽出含有所需量磁珠悬浮液的体积。例如，要制备一毫升珠子悬浮液，请取出含有 20 毫克珠子的体积。

将珠悬浮液放在磁性架上一分钟，然后除去上清液。用等体积的I型水洗涤珠子两次，并在每次加入洗涤溶液后使用涡旋混合器混合。然后，再次将溶液放在磁性架上一分钟，并如前所示除去上清液。

加入酸处理抗体、0.5摩尔硼酸盐缓冲液和偶联缓冲液，用于抗体与磁珠偶联。使用涡旋混合器混合，并使用端到端样品混合器在环境温度下旋转过夜，最好是相互旋转和振动。然后，以239g离心10分钟。

将管放在磁铁上两分钟，然后除去上清液。洗涤珠子后，再次将管子放在磁铁上一分钟，然后按照相同的步骤除去上清液。在冰箱中使用所需的珠子原液浓度将其储存在所需的缓冲液中。

在 10 微升体积吸收微量采样或 VAMS 中收集 10 微升血清，使用制造商的指南进行尖端，并在环境温度下风干至少两个小时。从支架上取下VAMS，并将其放入两毫升低蛋白结合微量离心管中。加入1， 000微升100毫摩尔碳酸氢铵溶液，并使用温控混合器在22摄氏度下以1， 000 rpm提取VAMS一小时。

将提取物转移到新的1.5毫升低蛋白结合微量离心管中进行胰蛋白酶水解。向每个VAMS提取物中加入30微升洗涤的胰蛋白酶珠以启动消化，并使用温控混合器或类似方法在37摄氏度和1， 000rpm下孵育两小时。以2， 655g离心5分钟，并将上清液转移到新的两毫升低蛋白结合微量离心管中。

在100毫摩尔碳酸氢铵溶液中加入25微升每毫升14纳克内标或IS溶液，其中含有稳定同位素标记肽。向每个含有消化的VAMS提取物和IS的低蛋白结合微量离心管中加入两个20微升洗涤的磁珠悬浮液。在环境温度下使用端到端样品混合器进行免疫提取一小时。通过加入500微升PBS和0.05%聚山梨酯20来洗涤磁珠。

从磁性架上取出含有珠子和洗涤溶液的低蛋白结合微量离心管，并小心地倒置直至均匀。然后，将低蛋白结合微量离心管放在磁铁上30秒，倒置30秒，然后再次将其放在磁铁上一分钟。取出洗涤液，然后用PBS，三盐酸和碳酸氢铵重新洗涤磁珠。

向每个样品中加入15微升2%甲酸的I型水，并使用温控混合器或类似方法在22摄氏度和1， 000rpm下孵育5分钟，以洗脱捕获的肽。将洗脱液放在磁铁上一分钟后，将其转移到新的1.5毫升低蛋白结合微量离心管中。重复一次，并将第二个洗脱液转移到与第一个洗脱液相同的低蛋白结合微量离心管中。

向每个洗脱液中加入 20 微升 100 毫摩尔碳酸氢铵。离心，并将40微升洗脱液转移到HPLC小瓶的微插入物中。在仪器软件中，将柱炉温度设置为25摄氏度，流速设置为每分钟50微升。

然后，将样品放入自动进样器中。使用LC-MS/MS系统可用的软件制备包含要运行的样品的序列，并将进样体积设置为10微升。按仪器软件中的运行序列开始序列，并记录亲和捕获的ProGRP特异性胰蛋白酶肽的峰面积及其IS。此处显示了VAMS和干燥血清斑点或DSS采样后蛋白型肽和IS的质谱或MS色谱图，以及直接添加到提取溶液中的加标血清样品。

该图显示了蛋白型ProGRP肽与IS的峰面积比的代表性结果，用于加标ProGRP并应用于VAMS、DSS或直接应用于提取溶液的血清样品。从这些结果可以看出，VAMS提供的面积比与对照样品相似，表明对采样材料没有损失，而DSS提供的面积比明显较低，表明对采样材料的损失。该图比较了完整蛋白提取和蛋白型表位肽提取后的基峰色谱图。

当您自己制备抗体或酶包被微球时，您可以定制磁珠以满足您的特定需求。这与靶向蛋白质测定和全球蛋白质组学分析相关。从VAMS和干血斑中测定蛋白质的灵敏方法使得以患者为导向的方法（如院外检测）在更广泛的疾病随访中成为可能。