使用SCAD测定可视化疤痕形成 - 一种 非原位 皮肤疤痕测定

以前使用的体外或体外模型缺乏真皮细胞成分和皮肤组织的复杂性。这种非原位SCAD测定克服了一定的局限性，并能够研究受伤动物外部疤痕的发展。SCAD测定可以可视化皮肤微环境中的成纤维细胞迁移和疤痕形成。

它使激活剂或抑制剂的筛选库能够了解疤痕形成的机制基础。使用SCAD模型对平面文库进行高通量筛选分析，以了解伤口修复中涉及的基本过程和分子过程。SCAD测定很容易使用皮肤外植体进行。

对于一致的疤痕，建议选择产后第零天或第一天的皮肤。牺牲产后零日或第一天新生幼犬后，使用无菌手术刀小心切除1.5×1.5厘米全厚的背背皮肤，直到骨骼肌层。使用无菌弯曲镊子剥离皮肤，确保浅筋膜与下面的全皮肌完整。

用50至100毫升冷DMEM F-12培养基清洗切除的组织，以除去污染的血液。然后，用Hanks平衡盐溶液洗涤组织，以保持组织和细胞活力。将皮肤倒置，顶部有浅表筋膜，放入含有DMEM F-12培养基的10厘米培养皿中。

然后，使用一次性两毫米活检冲头，切除全层圆形皮肤碎片以产生结痂组织，确保浅筋膜完好无损，下层掌骨肌直到表皮。将200微升不含酚红的新鲜DMEM F-12完整培养基加入96孔板的每个孔中。使用无菌镊子，将单个结痂组织倒置并完全浸没到96孔板的孔中。

将板转移到维持在标准条件下的细胞培养箱中。在培养的第二天和第四天，除去在孔中留下10微升的培养基，并加入新鲜预热的DMEM F-12完整培养基以及处理化合物，以维持持续的细胞和组织活力条件。对于SCAD的实时成像，通过在微波炉中加热，在玻璃瓶中制备30毫升2至3%低熔点琼脂糖溶液PBS。

煮沸后，立即转移瓶子并将液体琼脂糖溶液在40摄氏度的水浴中冷却。接下来，将筋膜或疤痕朝上转移到35毫米培养皿的中心的SCAD组织上。然后使用1000微升移液器吸头将40摄氏度的琼脂糖液体缓慢倒入组织中，在室温下包埋SCAD。

琼脂糖在两分钟内聚合。聚合后，加入两毫升预热的DMEM F-12完整培养基。然后使用共聚焦或配备手稿中解释的合适孵育系统的多光子显微镜，获取第零天至第一天的延时图像。

对于组织收获，通过在相关时间点用无菌PBS替换培养基来洗涤组织。使用无菌镊子将每个SCAD转移到含有500微升2%多聚甲醛的1.5毫升微量离心管中，以在4摄氏度下固定组织过夜。第二天，用PBS洗涤组织三次，然后按照文本手稿中的描述进行二维或三维免疫荧光染色。

此处显示了 SCAD 在第 0 天和第 5 天的代表性全安装明场图像。Masson对垂直组织切片的三色染色揭示了组织瘢痕形成，组织收缩以及第0天和第5天瘢痕核心细胞外基质积聚的特征。显示了SCADs在第零天和第五天的免疫荧光染色。

从早期和晚期瘢痕，根深蒂固的阳性成纤维细胞显示为绿色，根深蒂固的阴性成纤维细胞显示为红色。对于三维成像，将组织嵌入琼脂糖溶液中并在上面加PBSGT。具有代表性的图像展示了N-钙粘蛋白在第五天SCAD的疤痕部位的独家定位。

配备孵育室的三维延时成像装置显示了成纤维细胞群在前12小时或疤痕发育的早期阶段进展的早期事件。这里给出了单个成纤维细胞在疤痕发育过程中单细胞跟踪细胞轨迹的图形表示。将SCAD组织倒置在孔板内以使筋膜朝上至关重要。

如果不这样做，将导致迁移模式不可避免地发生变化。该程序允许使用化学调节剂，中和抗体或病毒方法检查真皮层以进行治疗或培养。这有助于评估不同医疗环境中的病理性纤维化反应。

我们展示了连接蛋白-43和N-钙粘蛋白作为损伤时参与筋膜动员的关键分子的表达。SCAD方法允许确定新的治疗策略来减少瘢痕形成和纤维化。