I modelli precedentemente utilizzati in vitro o ex vivo mancano di componenti delle cellule dermiche e della complessità del tessuto cutaneo. Questo test SCAD ex situ supera una limitazione fissa e consente di studiare lo sviluppo di cicatrici al di fuori dell'animale ferito. Il test SCAD consente la visualizzazione della migrazione dei fibroblasti e della formazione di cicatrici nei microambienti cutanei.
Consente alle librerie di screening di attivatori o inibitori di comprendere le basi meccanicistiche della formazione di cicatrici. Saggi di screening ad alto rendimento di librerie piatte utilizzando il modello SCAD per comprendere il processo fondamentale e il corso molecolare coinvolto nella riparazione delle ferite. Il test SCAD è facile da eseguire utilizzando gli espianti cutanei.
Per cicatrici consistenti, si consiglia di selezionare la pelle post-natale giorno zero o giorno uno. Dopo aver sacrificato il giorno zero post-natale o il primo giorno del cucciolo appena nato, utilizzare un bisturi chirurgico sterile per asportare con cura la pelle dorsale dorsale a pieno spessore di 1,5 per 1,5 centimetri fino allo strato muscolare scheletrico. Sbucciare la pelle con una pinza curva sterile, assicurandosi che la fascia superficiale sia intatta con il muscolo carnoso pannicolo sottostante.
Lavare il tessuto asportato con 50-100 millilitri di mezzo DMEM F-12 freddo per rimuovere il sangue contaminante. Quindi, lavare il tessuto con la soluzione salina bilanciata Hanks per mantenere la vitalità dei tessuti e delle cellule. Posizionare la pelle a testa in giù con la fascia superficiale sulla parte superiore in una capsula di Petri di 10 centimetri contenente DMEM F-12 medio.
Quindi, utilizzando un punch bioptico monouso a due millimetri, asportare pezzi di pelle rotonda a tutto spessore per generare tessuti a croste, assicurando che la fascia superficiale sia intatta con il muscolo carnoso pannicolo sottostante fino all'epidermide. Aggiungere 200 microlitri di mezzo completo DMEM F-12 fresco senza rosso fenolo in ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. Usando una pinza sterile, trasferisci e immergi completamente il singolo tessuto scabbato a testa in giù nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
Trasferire la piastra in un incubatore di colture cellulari mantenuto in condizioni standard. Nei giorni due e quattro di coltura, rimuovere il mezzo lasciando 10 microlitri nel pozzo e aggiungere un mezzo completo DMEM F-12 preriscaldato fresco insieme ai composti di trattamento per mantenere condizioni di vitalità cellulare e tissutale continue. Per l'imaging dal vivo di SCAD, preparare 30 millilitri di soluzione di agarosio a bassa fusione dal 2 al 3% in PBS in una bottiglia di vetro riscaldando in un forno a microonde.
Dopo l'ebollizione, trasferire immediatamente la bottiglia e raffreddare la soluzione liquida di agarosio a bagnomaria a 40 gradi Celsius. Quindi, trasferire il tessuto SCAD con fascia o cicatrice rivolta verso l'alto al centro di un piatto da 35 millimetri. Quindi incorporare l'SCAD a temperatura ambiente versando lentamente agarosio liquido a 40 gradi Celsius sul tessuto utilizzando una punta della pipetta da 1000 microliti.
L'agarosio polimerizza entro due minuti. Dopo la polimerizzazione, aggiungere due millilitri di mezzo completo DMEM F-12 preriscaldato. Quindi utilizzando un microscopio confocale o multifotonico dotato di idonei sistemi di incubazione spiegati nel manoscritto, acquisire immagini time-lapse dal giorno zero al primo giorno.
Per la raccolta dei tessuti, lavare i tessuti nei punti temporali pertinenti sostituendo il supporto con PBS sterile. Utilizzando una pinza sterile, trasferire ogni SCAD in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di paraformaldeide al 2% per fissare i tessuti durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare i tessuti tre volte con PBS prima di procedere alla colorazione immunofluorescenza bidimensionale o tridimensionale come descritto nel manoscritto di testo.
Le immagini rappresentative a campo luminoso a montaggio intero degli SCAD nei giorni zero e cinque sono mostrate qui. La colorazione tricroma di Masson delle sezioni di tessuto verticale rivela le firme di cicatrici tissutali, contrazione tissutale e accumulo di matrice extracellulare al centro della cicatrice ai giorni zero e cinque. Viene mostrata la colorazione di immunofluorescenza degli SCAD ai giorni zero e cinque.
Dalla cicatrice in fase iniziale e avanzata, il fibroblasto positivo radicato è mostrato in verde e il fibroblasto negativo radicato in rosso. Per l'imaging tridimensionale, i tessuti sono stati incorporati in una soluzione di agarosio e sormontati da PBSGT. Le immagini rappresentative dimostrano la localizzazione esclusiva della proteina N-caderina nel sito cicatriziale di un SCAD del quinto giorno.
La configurazione tridimensionale di imaging time lapse dotata di una camera di incubazione ha mostrato i primi eventi di progressione degli sciami di fibroblasti nelle prime 12 ore o nelle prime fasi dello sviluppo della cicatrice. La rappresentazione grafica delle traiettorie cellulari tracciate a singola cellula dei singoli fibroblasti sullo sviluppo della cicatrice è presentata qui. È fondamentale posizionare il tessuto SCAD a testa in giù all'interno della piastra del pozzo in modo che la fascia sia rivolta verso l'alto.
In caso contrario, si verificherebbero inevitabili variazioni nei modelli di migrazione. Questa procedura consente di esaminare gli strati dermici per trattamenti o colture utilizzando modulatori chimici, anticorpi neutralizzanti o metodi virali. Questo aiuta nella valutazione delle risposte fibrotiche patologiche in diversi contesti medici.
Abbiamo mostrato l'espressione di connexina-43 e N-caderina come molecole chiave coinvolte nella mobilizzazione della fascia al momento della ferita. La metodologia SCAD consente l'identificazione di nuove strategie terapeutiche per ridurre cicatrici e fibrosi.
