该协议允许制造骨类似物，而无需加热或有毒化学品。通过这种方式，骨结构形成，有可能在临床环境中使用患者自身的细胞修复骨缺损。该技术的主要优点是骨墨水可以用活细胞打印，以形成任何复杂的骨样结构，并直接分化为骨形成谱系。
此外，药物可以加载到骨墨水中，以同时增强伤口愈合，骨骼再生以及治疗癌症等疾病。演示该程序的将是我实验室的博士候选人Gagan Jalandhra和Sara Romanazzo博士，他与我和Jalandhra博士合作过各种项目，包括这项技术的开发。首先将磷酸氢钙和碳酸钙粉末混合物添加到氧化锆坩埚中，使其不超过75%。
将坩埚转移到炉子中，以每分钟5摄氏度的速度将其加热至1， 400摄氏度，并保持三小时。通过将坩埚从炉中取出并留在耐火块顶部来淬灭反应。在处理之前让它完全冷却。
使用研钵和研杵破碎和研磨α-磷酸三钙饼，使所得颗粒的最大尺寸为200微米。在研磨的混合物中加入三毫米氧化钇稳定的氧化锆球，然后加入 100% 乙醇。盖上盖子并以每分钟 180 转的速度研磨两小时。
收集悬浮液并分离球，使用100%乙醇进行洗涤。将悬浮液在 120 摄氏度的烤箱中干燥 24 小时。将干粉加入带有一毫米氧化锆球和100%乙醇的研磨罐中，重量比与第一阶段相同。
以每分钟 180 转的速度研磨两小时。然后分开并在烤箱中干燥。从烤箱中取出样品。
要制作骨墨，将 630 微升甘油和 130 微升聚山梨酯 80 加入球形罐中。然后在溶液中加入100毫克磷酸二铵和2克α-磷酸三钙粉，用刮刀连续搅拌混合。加入一个 25 毫米的氧化锆球，盖上盖子并将其放入行星磨机内以每分钟 180 转的速度放置 60 分钟，中途停顿以使用刮刀用刮刀刮下罐子的侧面。
将墨水装入一毫升注射器中。按照文本手稿中的说明，在1X PBS中制备10%的A型明胶溶液。将锥形烧瓶放在搅拌器上。
然后加入5.796毫升甲基丙烯酸酐，继续在50摄氏度的黑暗中搅拌90分钟。通过用PBS将锥形烧瓶内容物稀释两倍来淬灭反应。倒入50毫升管中，通过在室温下以3000 RCF离心3分钟并收集上清液来除去未反应的甲基丙烯酸酐。
将14千道尔顿截止纤维素透析管内的上清液与40摄氏度的去离子水透析五天，同时轻轻搅拌。每天更换去离子水。通过将倾析到50毫升管中，固定盖子并将其放入冰箱中12小时来准备储存。
然后使用液氮冷冻样品，并立即在零下54摄氏度和0.4毫巴下冻干五天。将产生的泡沫储存在零下 20 摄氏度的冰箱中。为了合成GelMA微凝胶，通过称量冻干的GelMA，将其加入带有PBS的管中并在50摄氏度的水浴中加热直至完全水合，在PBS中制备重量为10%重量的GelMA溶液。
每一毫升GelMA溶液向烧杯中加入37毫升油，确保其不超过65%。通过将装有油的烧杯放入较大的烧杯中，在带有磁力搅拌的热板上设置双烧杯系统。搅拌时加热至40摄氏度。
将GelMA溶液装入注射器中，并通过0.45微米过滤器将其滴加到搅拌油中。让乳液平衡10分钟。将乳液的温度降低到15摄氏度以加热。
通过在两个烧杯之间的空间中添加碎冰来稳定球体。将丙酮添加到旋转的GelMA乳液中。将烧杯的内容物倒入 50 毫升管中，确保用丙酮清洗烧杯壁。
让它静置 20 分钟，让脱水的微凝胶沉降到底部。弃去上清液并用丙酮洗涤微凝胶两次。合并成一个管，加满丙酮并超声处理 10 秒钟。
再次，用丙酮清洗两次。在室温下储存在丙酮中，直到需要打印。为了制备用于印刷的GelMA微凝胶悬浮液，请按照文本手稿中所述在DMEM中配制1%重量重量的GelMA溶液。
从脱水的微凝胶中蒸发丙酮，并将所得粉末称量到管中。加入丙酮并转移到无菌环境中。为了形成微凝胶悬浮液，从生物安全柜内的粉末中蒸发丙酮。
蒸发后，加入DMEM，DMEM中的1%GelMA溶液和2.5%LAP引发剂溶液，使最终包装分数达到30%，允许在室温下充分水合至少12小时。在补充有10%FBS和1%青霉素链霉素的低葡萄糖DMEM中培养脂肪来源的间充质干细胞，在37摄氏度和5%二氧化碳下直至汇合。通过去除培养基并用无菌PBS洗涤，从组织培养瓶中去除脂肪来源的间充质干细胞。
通过在室温下以 150 RCF 离心五分钟来沉淀细胞。计数细胞并计算每毫升GelMA微凝胶的至少5 x 10到五个细胞。如前所述，将所需体积的细胞悬液分配到单独的管和沉淀中。
使用移液管小心地去除尽可能多的上清液，只留下细胞沉淀。将所需体积的微凝胶悬浮液添加到沉淀中，轻轻上下移液以确保均匀分布。使用移液管将装有细胞的微凝胶悬浮液装入反应器中。
使用装有 23 号针头的一毫升注射器，将骨墨沉积，用 405 纳米的紫外线交联剂灯交联细胞和含有骨墨的 GelMA 微凝胶构建体 90 秒。立即将微凝胶悬浮液转移到含有完整DMEM的适当大小的孔板中。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。
24小时后更换培养基，然后根据需要每48至72小时更换一次。通过扫描电镜分析骨墨以确定其微观结构，结果表明油墨凝固后形成羟基磷灰石晶体，在干燥条件下尤其明显。在这项研究中，将细胞与GelMA微凝胶混合并在培养物中保持长达五天，无论是仅在微凝胶悬浮液中还是在COBISS系统中。
细胞在骨墨存在下，在第一天和第五天都显示出良好的活力，证实了墨水的浸出产物对细胞无害。在合成微凝胶时控制搅拌器速度至关重要，因为搅拌的微小变化会导致尺寸差异。确保微凝胶悬浮液内细胞的均匀分布也很重要。
相同的方案可用于在明胶微凝胶悬浮液内部打印，其作为牺牲支撑物，留下独立的骨结构。但是使用GelMA为一盆多相结构开辟了途径，例如骨软骨或骨肌腱界面。
