Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von Knochenanaloga, ohne dass Erhitzung oder toxische Chemikalien erforderlich sind. Auf diese Weise entstehen Knochenstrukturen, die das Potenzial haben, einen Knochendefekt im klinischen Umfeld mit patienteneigenen Zellen zu reparieren. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass die Knochentinte mit lebenden Zellen gedruckt werden kann, um eine komplexe knochenähnliche Struktur zu bilden und die Differenzierung in Richtung knochenbildender Linie zu lenken.
Darüber hinaus können Medikamente in die Knochentinte geladen werden, um gleichzeitig die Wundheilung, die Knochenregeneration und die Behandlung von Krankheiten wie Krebs zu verbessern. Gagan Jalandhra, ein Doktorand in meinem Labor, und Dr. Sara Romanazzo, die mit mir und Dr. Jalandhra an verschiedenen Projekten gearbeitet hat, einschließlich der Entwicklung dieser Technologie, werden das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Zugabe der Mischung aus Calciumhydrogenphosphat und Calciumcarbonatpulver zu einem Zirkonoxidtiegel, so dass er nicht mehr als 75% gefüllt ist.
Den Tiegel in einen Ofen überführen, auf 1.400 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von fünf Grad Celsius pro Minute erhitzen und drei Stunden halten. Die Reaktion wird abgeschreckt, indem der Tiegel aus dem Ofen genommen und oben auf dem feuerfesten Block belassen wird. Lassen Sie es vor der Handhabung vollständig abkühlen.
Verwenden Sie einen Mörser und einen Stößel, um den Alpha-Tricalciumphosphat-Kuchen zu brechen und zu mahlen, so dass das resultierende Granulat eine maximale Größe von 200 Mikrometern hat. Geben Sie drei Millimeter Yttrium-stabilisierte Zirkonoxidkugeln zu der gemahlenen Mischung, gefolgt von 100% Ethanol. Sichern Sie den Deckel und schleifen Sie ihn zwei Stunden lang mit 180 Umdrehungen pro Minute.
Sammeln Sie die Suspension und trennen Sie die Kugeln mit 100% Ethanol zum Waschen. Trocknen Sie die Suspension im Ofen bei 120 Grad Celsius für 24 Stunden. Geben Sie das getrocknete Pulver in die Mahlgläser mit einem Millimeter Zirkonia-Kugeln und 100% Ethanol im gleichen Gewichtsverhältnis wie in der ersten Stufe.
Mahlen Sie zwei Stunden lang mit 180 Umdrehungen pro Minute. Dann trennen und im Ofen trocknen. Nehmen Sie die Probe aus dem Ofen.
Um die Knochentinte herzustellen, geben Sie 630 Mikroliter Glycerin und 130 Mikroliter Polysorbat 80 in ein Kugelglas. Dann geben Sie 100 Milligramm Ammoniumphosphat zweibasisch und zwei Gramm Alpha-Tricalciumphosphat-Pulver in die Lösung und rühren Sie kontinuierlich mit einem Spatel um, um zu vermischen. Fügen Sie eine 25-Millimeter-Zirkonia-Kugel hinzu, befestigen Sie den Deckel und legen Sie ihn für 60 Minuten mit 180 Umdrehungen pro Minute in eine Planetenmühle, wobei Sie auf halbem Weg pausieren, um die Seiten des Glases mit einem Spatel mit einem Spatel mit einem Spatel abzukratzen.
Legen Sie die Tinte in eine Ein-Milliliter-Spritze. Machen Sie eine 10%ige Lösung von Gelatine Typ A in 1X PBS, wie im Textmanuskript beschrieben. Setzen Sie den Erlenmeyerkolben auf den Rührer.
Dann 5,796 Milliliter Methacrylanhydrid zugeben und im Dunkeln bei 50 Grad Celsius 90 Minuten weiterrühren. Die Reaktion wird abgeschreckt, indem der Inhalt des Erlenmeyerkolbens mit PBS zweifach verdünnt wird. In 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen und das nicht umgesetzte Methacrylanhydrid durch Zentrifugieren bei 3000 RCF bei Raumtemperatur für drei Minuten und Auffangen des Überstands entfernen.
Dialysieren Sie den Überstand in 14 Kilodalton geschnittenen Zellulose-Dialyseröhrchen gegen deionisiertes Wasser bei 40 Grad Celsius für fünf Tage unter vorsichtigem Rühren. Ersetzen Sie das deionisierte Wasser jeden Tag. Bereiten Sie sich auf die Lagerung vor, indem Sie in 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen, die Kappe befestigen und für 12 Stunden in den Kühlschrank stellen.
Dann die Proben mit flüssigem Stickstoff einfrieren und sofort fünf Tage lang bei minus 54 Grad Celsius und 0,4 Millibar lyophilisieren. Lagern Sie den entstandenen Schaum in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Um GelMA-Mikrogele zu synthetisieren, stellen Sie eine GelMA-Lösung mit 10 Gewichtsprozent in PBS her, indem Sie das lyophilisierte GelMA wiegen, es in ein Röhrchen mit PBS geben und in einem Wasserbad bei 50 Grad Celsius erhitzen, bis es vollständig hydratisiert ist.
Geben Sie 37 Milliliter Öl pro Milliliter GelMA-Lösung in ein Becherglas und stellen Sie sicher, dass es nicht mehr als 65% gefüllt ist. Stellen Sie ein Doppelbechersystem auf einer Heizplatte mit Magnetrühren auf, indem Sie das Becherglas mit Öl in ein größeres Becherglas legen. Unter Rühren auf 40 Grad Celsius erhitzen.
Füllen Sie die GelMA-Lösung in eine Spritze und geben Sie sie durch einen 0,45-Mikrometer-Filter tropfenweise in das Rühröl. Lassen Sie die Emulsion 10 Minuten einwirken. Reduzieren Sie die Temperatur der Emulsion auf 15 Grad Celsius thermisch.
Stabilisieren Sie die Kugeln, indem Sie zerstoßenes Eis in den Raum zwischen den beiden Bechergläsern geben. Fügen Sie der sich drehenden GelMA-Emulsion Aceton hinzu. Dekantieren Sie den Inhalt des Becherglases in 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Wände des Becherglases mit Aceton.
Lassen Sie es 20 Minuten ruhen, damit sich die dehydrierten Mikrogele auf dem Boden absetzen können. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Mikrogele zweimal mit Aceton. In einem Röhrchen konsolidieren, mit Aceton auffüllen und 10 Sekunden lang beschallen.
Wieder zweimal mit Aceton waschen. In Aceton bei Raumtemperatur aufbewahren, bis es für den Druck benötigt wird. Um die GelMA-Mikrogel-Suspension für den Druck vorzubereiten, formulieren Sie eine 1 Gew.-%-Lösung von GelMA in DMEM, wie im Textmanuskript beschrieben.
Verdampfen Sie das Aceton aus den dehydrierten Mikrogelen und wiegen Sie das resultierende Pulver in ein Röhrchen. Fügen Sie Aceton hinzu und geben Sie es in eine sterile Umgebung. Um die Mikrogel-Suspension zu bilden, verdampfen Sie das Aceton aus dem Pulver in der Biosicherheitswerkbank.
Nach dem Verdampfen fügen Sie DMEM, 1% GelMA-Lösung in DMEM und 2,5% LAP-Initiatorlösung hinzu, um eine Endverpackungsfraktion von 30% zu erreichen. Kultur der aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stammzellen in DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zum Zusammenfluss. Entfernen Sie die aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus dem Gewebekulturkolben, indem Sie das Medium entfernen und mit sterilem PBS waschen.
Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 150 RCF bei Raumtemperatur zentrifugiert. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie mindestens 5 x 10 bis fünf Zellen für jeden Milliliter GelMA-Mikrogele. Weisen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension einem separaten Röhrchen und Pellet zu, wie zuvor gezeigt.
Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich mit einer Pipette, so dass nur das Zellpellet übrig bleibt. Geben Sie die erforderliche Menge an Mikrogel-Suspension in das Pellet und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Laden Sie die mit Mikrogel-Suspension beladene Zelle mit einer Pipette in einen Reaktor.
Scheiden Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die Knochentinte ab, vernetzen Sie die Zelle und die mit Knochentinte beladenen GelMA-Mikrogelkonstrukte mit einer UV-Vernetzerlampe bei 405 Nanometern für 90 Sekunden lang. Übertragen Sie die Mikrogel-Suspension sofort in eine Well-Platte mit entsprechender Größe, die vollständiges DMEM enthält. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Tauschen Sie das Nährmedium nach 24 Stunden aus, danach je nach Bedarf alle 48 bis 72 Stunden. Die Knochentinte wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie analysiert, um ihre Mikrostruktur zu bestimmen, die die Bildung von Hydroxylapatitkristallen nach dem Abbinden der Tinte zeigte, die besonders unter trockenen Bedingungen sichtbar war. In dieser Studie wurden Zellen mit GelMA-Mikrogelen gemischt und bis zu fünf Tage in Kultur gehalten, entweder nur in Mikrogelsuspension oder im COBICS-System.
Die Zellen zeigten sowohl am ersten als auch am fünften Tag eine gute Lebensfähigkeit in Gegenwart der Knochentinte, was bestätigte, dass die Auslaugungsprodukte der Tinte für die Zellen nicht schädlich waren. Es ist wichtig, die Rührgeschwindigkeit während der Synthese von Mikrogel zu kontrollieren, da eine geringfügige Veränderung des Rührens zu Größenunterschieden führen kann. Es ist auch wichtig, eine homogene Verteilung der Zellen innerhalb der Mikrogelsuspension zu gewährleisten.
Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um in Gelatine-Mikrogel-Suspensionen zu drucken, die als Opferträger fungieren und eigenständige Knochenkonstrukte zurücklassen. Die Verwendung von GelMA eröffnet jedoch den Weg für mehrphasige Eintopfkonstrukte wie osteochondrale oder Knochensehnenschnittstellen.
