이 프로토콜을 사용하면 가열 또는 독성 화학 물질없이 뼈 유사체를 제조 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 뼈 구조는 환자 자신의 세포를 사용하여 임상 환경에서 뼈 결함을 복구 할 수있는 가능성으로 형성됩니다. 이 기술의 주요 장점은 뼈 잉크를 살아있는 세포로 인쇄하여 복잡한 뼈와 같은 구조를 형성하고 뼈 형성 혈통으로 분화를 유도 할 수 있다는 것입니다.
또한 약물을 뼈 잉크에 로드하여 상처 치유, 뼈 재생을 동시에 향상시키고 암과 같은 병리를 치료할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사 과정 후보자 인 Gagan Jalandhra와 저와 Jalandhra 박사와 함께이 기술의 개발을 포함한 다양한 프로젝트에서 일한 Sara Romanazzo 박사입니다. 인산 수소 칼슘과 탄산 칼슘 분말 혼합물을 지르코니아 도가니에 첨가하여 75 % 이하가되도록합니다.
도가니를 용광로로 옮기고 분당 섭씨 5 도의 속도로 섭씨 1, 400도까지 가열하고 3 시간 동안 유지하십시오. 용광로에서 도가니를 제거하고 내화 블록의 상단에 남겨 두어 반응을 담금질하십시오. 취급하기 전에 완전히 식히십시오.
박격포와 유봉을 사용하여 알파-인산 삼 칼슘 케이크를 깨고 갈아서 결과 과립의 최대 크기가 200 마이크로 미터가되도록합니다. 분쇄 된 혼합물에 3 밀리미터 이트리아 안정화 지르코니아 볼을 첨가 한 다음 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 뚜껑을 단단히 닫고 분당 180 회전으로 2 시간 동안 분쇄하십시오.
현탁액을 모으고 세척을 위해 100 % 에탄올을 사용하여 볼을 분리하십시오. 현탁액을 섭씨 120도의 오븐에서 24시간 동안 건조시킨다. 건조 된 분말을 1 밀리미터 지르코니아 볼과 100 % 에탄올로 분쇄 용기에 첫 번째 단계와 동일한 중량비로 첨가하십시오.
분당 180 회전으로 2 시간 동안 분쇄하십시오. 그런 다음 오븐에서 분리하고 말리십시오. 오븐에서 샘플을 꺼냅니다.
뼈 잉크를 만들려면 630 마이크로 리터의 글리세롤과 130 마이크로 리터의 폴리 소르 베이트 80을 볼 밀 병에 첨가하십시오. 그런 다음 이염 기성 인산 암모늄 100mg과 알파-인산 삼 칼슘 분말 2g을 용액에 넣고 주걱으로 계속 저어 결합합니다. 25mm 지르코니아 볼을 넣고 뚜껑을 단단히 고정하고 분당 180 회전으로 60 분 동안 유성 분쇄기에 넣고 중간에 멈춰 주걱을 사용하여 주걱으로 항아리의 측면을 긁어냅니다.
1 밀리리터 주사기에 잉크를 넣으십시오. 텍스트 원고에 설명 된대로 1X PBS에서 젤라틴 유형 A의 10 % 용액을 만듭니다. 원뿔형 플라스크를 교반기에 놓습니다.
그런 다음 5.796 밀리리터의 메타 크릴 산 무수물을 넣고 섭씨 50도에서 90 분 동안 어둠 속에서 계속 저어줍니다. 원뿔형 플라스크 내용물을 PBS로 2배 희석하여 반응을 켄칭한다. 50 밀리리터 튜브에 디캔트하고 실온에서 3000 RCF에서 3분 동안 원심분리하여 미반응 메타크릴산 무수물을 제거하고 상층액을 수집하였다.
14 킬로달톤 컷오프 셀룰로스 투석관 내부의 상청액을 섭씨 40도에서 5일 동안 탈이온수에 대해 부드럽게 교반하면서 투석한다. 탈이온수를 매일 교체하십시오. 50 밀리리터 튜브로 디캔팅하고 캡을 고정하고 냉장고에 12 시간 동안 두어 보관할 준비를하십시오.
그런 다음 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결시키고 즉시 섭씨 영하 54도 및 0.4 밀리바에서 5 일 동안 동결 건조합니다. 생성 된 거품을 섭씨 영하 20 도의 냉동실에 보관하십시오. GelMA 마이크로젤을 합성하려면 동결건조된 GelMA의 무게를 측정하여 PBS에서 10중량%의 GelMA 용액을 만들고 PBS가 있는 튜브에 첨가하고 완전히 수화될 때까지 섭씨 50도의 수조에서 가열합니다.
비커에 GelMA 용액 1밀리리터당 오일 37밀리리터를 추가하여 65%를 넘지 않도록 합니다. 더 큰 비커 내부에 오일이 포함된 비커를 배치하여 자석 교반이 가능한 핫 플레이트에 이중 비커 시스템을 설정합니다. 교반하면서 섭씨 40도까지 가열합니다.
GelMA 용액을 주사기에 넣고 0.45 마이크로 미터 필터를 통해 교반 오일에 적가합니다. 에멀젼이 10 분 동안 평형을 이루도록하십시오. 에멀젼의 온도를 섭씨 15도까지 낮추어 열적으로 만듭니다.
두 비커 사이의 공간에 분쇄 된 얼음을 추가하여 구를 안정화합니다. 방사하는 GelMA 에멀젼에 아세톤을 첨가하십시오. 비커의 내용물을 50 밀리리터 튜브에 넣고 비커의 벽을 아세톤으로 씻으십시오.
탈수 된 마이크로 젤이 바닥에 정착 할 수 있도록 20 분 동안 그대로 두십시오. 상청액을 버리고 마이크로겔을 아세톤으로 두 번 세척한다. 하나의 튜브로 통합하고 아세톤으로 채우고 10 초 동안 초음파 처리합니다.
다시 아세톤으로 두 번 씻으십시오. 인쇄에 필요할 때까지 실온에서 아세톤에 보관하십시오. 인쇄용 GelMA 마이크로겔 현탁액을 제조하기 위해, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 DMEM 중 GelMA의 1중량% 중량% 용액을 제형화한다.
탈수 된 마이크로 겔에서 아세톤을 증발시키고 생성 된 분말을 튜브에 칭량합니다. 아세톤을 첨가하고 멸균 환경으로 옮깁니다. 마이크로겔 현탁액을 형성하려면 생물안전 캐비닛 내부의 분말에서 아세톤을 증발시킵니다.
증발 후 DMEM, DMEM에 1%GelMA 용액 및 2.5%LAP 개시제 용액을 추가하여 30%의 최종 패킹 분율을 달성하여 실온에서 최소 12시간 동안 완전히 수화되도록 허용합니다. 지방 유래 중간엽 줄기세포를 합류할 때까지 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 저혈당 DMEM에서 배양합니다. 지방유래 중간엽 줄기세포를 배지를 제거하고 멸균 PBS로 세척하여 조직배양 플라스크로부터 제거하였다.
실온에서 150 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 세포를 세고 GelMA 마이크로젤의 각 밀리리터에 대해 5개의 세포에 대해 최소 5 x 10을 계산합니다. 필요한 부피의 세포 현탁액을 앞에서 설명한 대로 별도의 튜브와 펠릿에 할당합니다.
피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿 만 남겨 둡니다. 필요한 양의 마이크로젤 현탁액을 펠릿에 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균일한 분포를 보장합니다. 마이크로겔 현탁액에 담긴 세포를 피펫을 사용하여 반응기에 넣습니다.
23 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 주사기를 사용하여 뼈 잉크를 증착하고 셀 및 뼈 잉크가 함유 된 GelMA 마이크로 겔 구조물을 405 나노 미터의 UV 가교 링커 램프로 90 초 동안 가교 결합시킵니다. 마이크로겔 현탁액을 완전한 DMEM을 포함하는 적절한 크기의 웰 플레이트로 즉시 옮깁니다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양하십시오.
배양 배지를 24시간 후에 교체한 다음, 필요에 따라 48 내지 72시간마다 교체한다. 뼈-잉크는 주사 전자 현미경으로 분석하여 미세 구조를 결정했으며, 이는 잉크 경화 후 수산화 인회석 결정의 형성을 보여 주었으며, 특히 건조한 조건에서 볼 수 있습니다. 이 연구에서 세포를 GelMA 마이크로 젤과 혼합하고 마이크로 겔 현탁액 만 또는 COBICS 시스템에서 최대 5 일 동안 배양 물에 보관했습니다.
세포는 1 일과 5 일 모두 뼈 잉크가있는 상태에서 양호한 생존력을 보여 잉크의 침출 생성물이 세포에 해롭지 않다는 것을 확인했다. 교반 속도를 조절하는 것이 중요하며, 마이크로겔을 합성하는 것은 약간의 변화로 교반하면 크기 차이가 발생할 수 있기 때문입니다. 마이크로겔 현탁액 내에서 세포의 균질한 분포를 보장하는 것도 중요합니다.
동일한 프로토콜을 사용하여 젤라틴 마이크로겔 현탁액 내부를 인쇄할 수 있으며, 이는 희생 지지체 역할을 하여 독립형 뼈 구조를 남깁니다. 그러나 GelMA를 사용하면 골 연골 또는 뼈 힘줄 인터페이스와 같은 하나의 냄비 다상 구조를위한 길을 열 수 있습니다.
