Bu protokol, ısıtma veya toksik kimyasallar gerektirmeden kemik analoglarının üretilmesine izin verir. Bu şekilde, hastanın kendi hücrelerini kullanarak klinik ortamlarda bir kemik defektini onarma potansiyeli olan kemik yapıları oluşturulur. Tekniğin temel avantajı, kemik mürekkebinin herhangi bir karmaşık kemik benzeri yapı oluşturmak ve farklılaşmayı kemik oluşturan soya doğru yönlendirmek için canlı hücrelerle basılabilmesidir.
Ayrıca, ilaçlar aynı anda yara iyileşmesini, kemik yenilenmesini arttırmak ve kanser gibi patolojileri tedavi etmek için kemik mürekkebine yüklenebilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora adayı olan Gagan Jalandhra ve bu teknolojinin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli projelerde benimle ve Dr. Jalandhra ile birlikte çalışan Dr. Sara Romanazzo olacak. Kalsiyum hidrojen fosfat ve kalsiyum karbonat tozu karışımını bir zirkonya potasına% 75'ten fazla dolu olmayacak şekilde ekleyerek başlayın.
Potayı bir fırına aktarın, dakikada beş santigrat derece hızla 1.400 santigrat dereceye ısıtın ve üç saat bekletin. Potayı fırından çıkararak ve refrakter bloğun tepesinde bırakarak reaksiyonu söndürün. Kullanmadan önce tamamen soğumasını bekleyin.
Alfa-trikalsiyum fosfat kekini kırmak ve öğütmek için bir harç ve havane kullanın, böylece elde edilen granüller maksimum 200 mikrometre büyüklüğüne sahip olacaktır. Öğütülmüş karışıma üç milimetre ittria stabilize zirkonya topu ekleyin, ardından% 100 etanol ekleyin. Kapağı sabitleyin ve dakikada 180 dönüşte iki saat boyunca taşlayın.
Süspansiyonu toplayın ve yıkama için% 100 etanol kullanarak topları ayırın. Süspansiyonu 24 saat boyunca 120 santigrat derecede bir fırında kurutun. Kurutulmuş tozu öğütme kavanozlarına bir milimetre zirkonya bilyesi ve %100 etanol ile ilk aşamada olduğu gibi aynı ağırlık oranlarında ekleyin.
Dakikada 180 dönüşte iki saat boyunca öğütün. Daha sonra fırında ayırın ve kurutun. Numuneyi fırından çıkarın.
Kemik-mürekkebi yapmak için, bir top mil kavanoza 630 mikrolitre gliserol ve 130 mikrolitre polisorbat 80 ekleyin. Daha sonra çözeltiye 100 miligram amonyum fosfat dibazik ve iki gram alfa-trikalsiyum fosfat tozu ekleyin ve birleştirmek için bir spatula ile sürekli karıştırın. 25 milimetrelik bir zirkonya topu ekleyin, kapağı sabitleyin ve dakikada 180 dönüşte 60 dakika boyunca bir planet değirmenin içine yerleştirin, kavanozun kenarlarını spatula kullanarak bir spatula ile kazımak için yarıya kadar durun.
Mürekkebi bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Metin makalesinde açıklandığı gibi 1X PBS'de% 10'luk bir jelatin tip A çözeltisi yapın. Konik şişeyi karıştırıcının üzerine yerleştirin.
Daha sonra 5.796 mililitre metakrilik anhidrit ekleyin ve karanlıkta 90 dakika boyunca 50 santigrat derecede karıştırmaya devam edin. Konik şişe içeriğini PBS ile iki kat seyrelterek reaksiyonu söndürün. 50 mililitrelik tüplere boşaltın ve reaksiyona girmemiş metakrilik anhidriti oda sıcaklığında 3000 RCF'de santrifüjleme ile üç dakika boyunca çıkarın ve süpernatanı toplayın.
14 kilodalton kesilmiş selüloz diyaliz tüplerinin içindeki süpernatantı beş gün boyunca 40 santigrat derecede deiyonize suya karşı hafifçe karıştırırken diyalize edin. Deiyonize suyu her gün değiştirin. 50 mililitrelik tüplere boşaltarak, kapağı sabitleyerek ve 12 saat boyunca buzdolabına koyarak depolamaya hazırlanın.
Daha sonra numuneleri sıvı azot kullanarak dondurun ve eksi 54 santigrat derece ve 0.4 milibarda beş gün boyunca hemen liyofilize edin. Elde edilen köpüğü eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın. GelMA mikrojellerini sentezlemek için, liyofilize GelMA'yı tartarak, PBS'li bir tüpe ekleyerek ve tamamen nemlendirilene kadar 50 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtarak PBS'de ağırlıkça% 10'luk bir GelMA çözeltisi yapın.
Bir beher'e bir mililitre GelMA çözeltisi başına 37 mililitre yağ ekleyin ve% 65'ten fazla dolu olmadığından emin olun. Yağ içeren beheri daha büyük bir beherin içine yerleştirerek manyetik karıştırmalı bir sıcak plaka üzerine çift beher sistemi kurun. Karıştırırken 40 santigrat dereceye ısıtın.
GelMA çözeltisini bir şırıngaya yükleyin ve 0.45 mikrometrelik bir filtreden karıştırma yağına damla damla ekleyin. Emülsiyonun 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Emülsiyonun sıcaklığını termal olarak 15 santigrat dereceye düşürün.
İki beher arasındaki boşluğa ezilmiş buz ekleyerek küreleri stabilize edin. Eğirme GelMA emülsiyonuna aseton ekleyin. Beherin içeriğini 50 mililitrelik tüplere boşaltın, beherin duvarlarını asetonla yıkadığınızdan emin olun.
Susuz mikro jellerin dibe çökmesine izin vermek için 20 dakika dinlendirin. Süpernatantı atın ve mikrojelleri asetonla iki kez yıkayın. Tek bir tüpte birleştirin, asetonla doldurun ve 10 saniye boyunca sonikasyon yapın.
Yine, iki kez asetonla yıkayın. Baskı için gerekli olana kadar oda sıcaklığında asetonda saklayın. GelMA mikrojel süspansiyonunu baskıya hazırlamak için, metin makalesinde açıklandığı gibi DMEM'de ağırlıkça %1'lik bir GelMA çözeltisi formüle edin.
Asetonu kurutulmuş mikrojellerden buharlaştırın ve elde edilen tozu bir tüpe tartın. Aseton ekleyin ve steril bir ortama aktarın. Mikrojel süspansiyonunu oluşturmak için, asetonu biyogüvenlik kabini içindeki tozdan buharlaştırın.
Evaporasyondan sonra,% 30'luk bir son ambalaj fraksiyonu elde etmek için DMEM,% 1 GelMA çözeltisi ve% 2.5 LAP başlatıcı çözeltisi ekleyin Oda sıcaklığında en az 12 saat boyunca tamamen hidratasyona izin verin. Düşük glukoz DMEM'deki adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin, 37 santigrat derecede %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ve birleşene kadar %5 karbondioksit ile desteklendiği kültür. Yağ türevi mezenkimal kök hücreleri, ortamı çıkararak ve steril PBS ile yıkayarak doku kültürü şişesinden çıkarın.
Hücreleri oda sıcaklığında 150 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj yaparak toplayın. Hücreleri sayın ve her mililitre GelMA mikrojeli için beş hücreye en az 5 x 10 hesaplayın. Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini daha önce gösterildiği gibi ayrı bir tüp ve pelete ayırın.
Bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatantı dikkatlice çıkarın ve sadece hücre peletini bırakın. Pelet üzerine gerekli miktarda mikrojel süspansiyon ekleyin ve eşit dağılımı sağlamak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Mikrojel süspansiyondaki hücre yüklüyü pipet kullanarak bir reaktöre yükleyin.
23 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, kemik mürekkebini biriktirin, hücreyi çapraz bağlayın ve kemik-mürekkep yüklü GelMA mikrojeli, 90 saniye boyunca 405 nanometrede bir UV çapraz bağlayıcı lamba ile inşa edilir. Mikrojel süspansiyonunu derhal tam DMEM içeren uygun boyutta bir kuyu plakasına aktarın. 37 santigrat derecede ve % 5 karbondioksitte inkübe edin.
Kültür ortamını 24 saat sonra, daha sonra gerektiği gibi her 48 ila 72 saatte bir değiştirin. Kemik mürekkebi, özellikle kuru koşullarda görülebilen mürekkep ayarından sonra hidroksiapatit kristalinin oluşumunu gösteren mikro yapısını belirlemek için taramalı elektron mikroskobu ile analiz edildi. Bu çalışmada, hücreler GelMA mikrojelleri ile karıştırıldı ve sadece mikro jel süspansiyonunda veya COBICS sisteminde beş güne kadar kültürde tutuldu.
Hücreler, kemik mürekkebinin varlığında, hem birinci hem de beşinci günde, mürekkebin sızıntı ürünlerinin hücrelere zararlı olmadığını doğrulayan iyi bir canlılık gösterdi. Mikrojeli sentezlerken karıştırma hızını kontrol etmek çok önemlidir, çünkü karıştırma küçük bir değişiklik boyut farklılıklarına neden olabilir. Mikrojel süspansiyonu içindeki hücrelerin homojen dağılımını sağlamak da önemlidir.
Aynı protokol, bağımsız kemik yapılarını geride bırakarak kurban desteği görevi gören jelatin mikrojel süspansiyonların içine baskı yapmak için de kullanılabilir. Ancak GelMA'yı kullanmak, osteokondral veya kemik tendon arayüzleri gibi bir pot multifazik yapı için yol açar.
