このプロトコルは、加熱または有毒化学物質を必要とせずに骨類似体の製造を可能にする。このようにして、患者自身の細胞を使用して臨床現場で骨欠損を修復する可能性のある骨構造が形成されます。この技術の主な利点は、骨インクを生細胞で印刷して、複雑な骨様構造を形成し、骨形成系統に分化させることができることです。
さらに、薬物を骨インクに装填して、創傷治癒、骨再生を同時に増強し、癌などの病状を治療することができます。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の候補者であるGagan Jalandhraと、この技術の開発を含むさまざまなプロジェクトで私とJalandhra博士と協力してきたSara Romanazzo博士です。リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウム粉末の混合物をジルコニアるつぼに75%以下になるように添加することから始めます。
るつぼを炉に移し、毎分5°Cの割合で1, 400°Cに加熱し、3時間保持します。るつぼを炉から取り出し、耐火物ブロックの上部に残して反応を急冷します。取り扱う前に完全に冷ましてください。
乳鉢と乳棒を使用して、得られた顆粒の最大サイズが200マイクロメートルになるようにアルファリン酸三カルシウムケーキを破って粉砕します。粉砕混合物に3ミリメートルのイットリア安定化ジルコニアボールを加え、続いて100%エタノールを加えます。蓋をしっかり固定し、毎分180回転で2時間粉砕します。
懸濁液を収集し、洗浄に100%エタノールを使用してボールを分離します。懸濁液を摂氏120度のオーブンで24時間乾燥させます。乾燥粉末を、1ミリメートルのジルコニアボールと100%エタノールを第1段階と同じ重量比で粉砕ジャーに加える。
毎分180回転で2時間粉砕します。その後、分離してオーブンで乾かします。オーブンからサンプルを取り出します。
骨インクを作るには、630マイクロリットルのグリセロールと130マイクロリットルのポリソルベート80をボールミルジャーに加えます。次に、100ミリグラムのリン酸二アンモニウムと2グラムのアルファ - リン酸三カルシウム粉末を溶液に加え、スパチュラで連続的に攪拌して混ぜ合わせます。25ミリメートルのジルコニアボールを追加し、蓋を固定し、毎分180回転で60分間遊星ミルの中に置き、ヘラを使用してヘラで瓶の側面をこすり落とすために途中で一時停止します。
インクを1ミリリットルのシリンジに入れます。テキスト原稿に記載されているように、1X PBSでゼラチンタイプAの10%溶液を作ります。円錐形のフラスコをスターラーの上に置きます。
次に、5.796ミリリットルの無水メタクリル酸塩を加え、摂氏50度の暗所で90分間攪拌を続けます。円錐フラスコ内容物をPBSで2倍に希釈して反応を消光する。50ミリリットルチューブにデカントし、室温で3分間、3000RCFで遠心分離することにより未反応のメタクリル酸無水物を除去し、上清を回収した。
14キロダルトンカットオフセルロース透析チューブ内の上清を、穏やかに攪拌しながら、摂氏40度の脱イオン水に対して5日間透析します。脱イオン水を毎日交換してください。50ミリリットルのチューブにデカントし、キャップを固定して冷蔵庫に12時間入れて、保管の準備をします。
次に、液体窒素を使用してサンプルを凍結し、すぐに摂氏マイナス54度、0.4ミリバールで5日間凍結乾燥します。得られた泡をマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。GelMAミクロゲルを合成するには、凍結乾燥されたGelMAを秤量し、PBSを含むチューブに加え、完全に水和するまで摂氏50度の水浴中で加熱することにより、PBS中の10重量%のGelMA溶液を作ります。
ビーカーにGelMA溶液1ミリリットルあたり37ミリリットルのオイルを加え、65%以下になるようにします。大きなビーカーの中に油を含むビーカーを入れて、磁気攪拌しながらホットプレートにダブルビーカーシステムをセットアップします。攪拌しながら摂氏40度に加熱する。
GelMA溶液をシリンジに入れ、0.45マイクロメートルのフィルターを通して攪拌油に滴下します。エマルジョンを10分間平衡化させます。エマルジョンの温度を摂氏15度に下げて熱的にします。
2つのビーカーの間のスペースに砕いた氷を追加して、球体を安定させます。紡糸GelMAエマルジョンにアセトンを加える。ビーカーの内容物を50ミリリットルのチューブにデカントし、ビーカーの壁をアセトンで洗ってください。
脱水したマイクロゲルが底に沈殿するように20分間休ませます。上清を捨て、アセトンでミクロゲルを2回洗浄する。1本のチューブに統合し、アセトンを補充し、10秒間超音波処理します。
繰り返しますが、アセトンで2回洗ってください。印刷が必要になるまで室温でアセトンで保管してください。印刷用のGelMAミクロゲル懸濁液を調製するために、テキスト原稿に記載されているようにDMEM中のGelMAの1重量%重量%溶液を処方する。
脱水ミクロゲルからアセトンを蒸発させ、得られた粉末をチューブに秤量する。アセトンを加えて無菌環境に移します。ミクロゲル懸濁液を形成するには、バイオセーフティキャビネット内の粉末からアセトンを蒸発させます。
蒸発後、DMEM、DMEM中の1%GelMA溶液、および2.5%LAP開始剤溶液を加えて、30%の最終充填率を達成し、室温で少なくとも12時間完全に水和させます。脂肪由来間葉系幹細胞を、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEMで、摂氏37度と5%二酸化炭素でコンフルエントになるまで培養します。培地を除去し、滅菌PBSで洗浄することにより脂肪由来間葉系幹細胞を組織培養フラスコから取り出した。
室温で150 RCFで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。細胞を数え、GelMAミクロゲルのミリリットルごとに少なくとも5 x 10から5つの細胞を計算します。前に示したように、必要量の細胞懸濁液を別のチューブとペレットに割り当てます。
ピペットを使用してできるだけ多くの上清を慎重に取り除き、細胞ペレットのみを残します。必要量のミクロゲル懸濁液をペレットに加え、ゆっくりと上下にピペットで動かして、均一な分布を確保します。細胞を含んだミクロゲル懸濁液をピペットを用いて反応器に装填する。
23ゲージの針を取り付けた1ミリリットルのシリンジを使用して、骨インクを堆積させ、細胞を架橋し、骨インクを含むGelMAミクロゲル構築物をUV架橋剤ランプで405ナノメートルで90秒間架橋します。直ちにミクロゲル懸濁液を、完全なDMEMを含む適切なサイズのウェルプレートに移します。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。
24時間後に培養液を交換し、必要に応じて48〜72時間ごとに交換します。骨インクを走査型電子顕微鏡で分析して微細構造を決定し、インク硬化後にハイドロキシアパタイト結晶の形成を示し、特に乾燥状態で可視でした。この研究では、細胞をGelMAミクロゲルと混合し、マイクロゲル懸濁液のみまたはCOBICSシステムのいずれかで最大5日間培養しました。
細胞は、1日目と5日目の両方で骨インクの存在下で良好な生存率を示し、インクの浸出生成物が細胞に有害ではないことを確認しました。微妙な変化がサイズの違いを引き起こす可能性があるため、ミクロゲルを合成しながら攪拌速度を制御することが重要です。ミクロゲル懸濁液内の細胞の均一な分布を確保することも重要です。
同じプロトコルを使用して、犠牲支持体として機能し、独立した骨構築物を残すゼラチンミクロゲル懸濁液の内部に印刷することができます。しかし、GelMAを使用すると、骨軟骨や骨腱の界面などのワンポット多相構造への道が開かれます。
