研究细胞内囊泡破裂功能的光动力方法

囊泡内吞作用成细胞增生导致细胞内囊泡的形成。囊泡的透化激活各种信号通路。发色团辅助激光灭活用于研究细胞内囊泡破裂的后果。

通过调整站立条件和光照，可以实现亚细胞对细胞内囊泡损伤的空间和时间控制。首先，在补充有10%FBS的DMEM中维持HeLa细胞培养。用PBS洗涤细胞后，胰蛋白酶消化细胞。

然后将细胞重悬于补充有10%FBS的DMEM中。在25微升还原血清培养基中稀释300纳克Gal3-GFP质粒。然后加入0.6微升P3000试剂。

并轻轻混合，然后涡旋溶液。将0.45微升脂质胺3000试剂稀释在25微升还原血清培养基中并轻轻混合。在室温下孵育五分钟。

然后将稀释的DNA和稀释的脂质胺3000混合，并在室温下孵育10分钟。将DNA脂质胺混合物，300， 000个悬浮的HeLa细胞和200微升DMEM与10%FBS混合后，将细胞接种在35毫米玻璃纽扣培养皿的中心玻璃区域。为了允许细胞附着，将细胞在37摄氏度的培养箱中以5%二氧化碳孵育至少四个小时。

在补充有10%FBS的DMEM中稀释AlPcS2a，制成一微摩尔AlPcS2a溶液。在37摄氏度的水浴中预热含有AlPcS2a的培养基，并用含AlPcS2a的培养基替换培养基。将细胞在37摄氏度下在提供5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。

第二天，用PBS洗涤细胞两次，用新鲜培养基替换培养基后去除细胞外AlPcS2a。在 37 摄氏度下孵育 4 小时，以使沿内吞途径的残留染料积聚成溶酶体。要通过破坏溶酶体来操纵单细胞，请将培养皿放在共聚焦显微镜的载物台上。

分别使用 488 纳米和 561 纳米激光器激发 GFP 和 AlPcS2a。在选择被选中要损坏的AlPcS2a标记的囊泡上圈出一个五乘五微米的感兴趣区域。然后用0.21毫瓦的633纳米激光或70次重复脉冲照亮感兴趣的区域。

监测Gal3点的形成作为溶酶体膜透化的指标。使用市售标记物在HeLa细胞中用AlPcS2a进行溶酶体染色，并用绿色荧光染料进行阳性染色。TagRFP-半乳糖凝集素3中表达的HeLa细胞中的溶酶体用AlPcS2a染色。

随后用近红外光聚焦照明，结果表明基于AlPcS2a的发色团辅助激光灭活能够控制感兴趣区域内的局部溶酶体破裂，使其余溶酶体保持完整。这一步很重要，因为孵育时间将决定站立的内体或溶酶体。例如，人们可以通过释放膜不透性染料来确定大小。

也可以使用pH敏感染料，如FITC葡聚糖来区分内体和溶酶体。该技术有助于启动细胞内囊泡膜破裂的下游效应。并且在各种情况下都有下游影响。