Эндоцитоз везикулы в цитоплазию приводит к образованию внутриклеточных везикул. Пермеабилизация везикулы активирует различные сигнальные пути. Хромофорная лазерная инактивация используется для изучения последствий разрыва внутриклеточных везикул.
Пространственный и временной контроль субклеточного повреждения внутриклеточных везикул может быть достигнут путем регулировки состояния стояния и светового освещения. Для начала поддерживайте культуру клеток HeLa в DMEM с добавлением 10% FBS. После промывки клеток PBS трипсинизируйте клетки.
Затем ресуспендируют клетки в DMEM с добавлением 10% FBS. Разведите 300 нанограмм плазмиды Gal3-GFP в 25 микролитрах восстановленной сывороточной среды. Затем добавьте 0,6 микролитра реактива P3000.
И аккуратно перемешивают, после чего перемешивают раствор. Разведите 0,45 микролитра реактива Липофектамин 3000 в 25 микролитрах восстановленной сывороточной среды и аккуратно перемешайте. Инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре.
Затем смешайте разбавленную ДНК и разведенный Lipofectamine 3000 и выдержите 10 минут при комнатной температуре. После смешивания смеси ДНК липофектамина 300 000 суспендированных клеток HeLa и 200 микролитров DMEM с 10% FBS засевают клетки в центральную стеклянную область 35-миллиметровой стеклянной пуговицы. Чтобы обеспечить прикрепление клеток, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, снабженном 5% углекислым газом, в течение не менее четырех часов.
Разбавьте AlPcS2a в DMEM с добавлением 10% FBS, чтобы получить один микромолярный раствор AlPcS2a. Предварительно подогрейте среду, содержащую AlPcS2a, на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия и замените питательную среду средой, содержащей AlPcS2a. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе, снабженном 5% углекислого газа в течение ночи.
На следующий день дважды промойте клетки PBS, чтобы удалить внеклеточный AlPcS2a после замены среды свежей средой. Инкубируйте при температуре 37 градусов по Цельсию в течение четырех часов, чтобы остаточный краситель вдоль эндоцитарного пути накапливался в лизосомах. Чтобы манипулировать отдельными клетками, повреждая лизосомы, поместите культуральную чашку на столик конфокального микроскопа.
Используйте 488-нанометровый и 561-нанометровый лазеры для возбуждения GFP и AlPcS2a соответственно. Обведите квадратную область размером пять на пять микрометров, представляющую интерес, на везикулах, меченных AlPcS2a, которые выбраны для повреждения. Затем импульс осветит интересующую область 633-нанометровым лазером мощностью 0,21 милливатта, или 70 повторов.
Следите за образованием Gal3 puncta как индикатора пермеабилизации лизосомальной мембраны. Лизосомальное окрашивание AlPcS2a в клетках HeLa проводили с использованием коммерчески доступных маркеров и положительно окрашивали зеленым флуоресцентным красителем. Лизосомы в клетках HeLa, экспрессируемых TagRFP-Galectin3, окрашивали AlPcS2a.
С последующей фокусировкой освещения ближним инфракрасным светом результаты показывают, что хромофорная лазерная инактивация на основе AlPcS2a смогла контролировать локальный лизосомальный разрыв в интересующей области, оставляя остальные лизосомы нетронутыми. Этот шаг важен, потому что время инкубации определит стоящие эндосомы или лизосомы. Например, люди могут определить размер по выделению мембранно-непроницаемого красителя.
Также можно использовать pH-чувствительные красители, такие как декстран FITC, для различий эндосом и лизосом. Этот метод полезен для запуска последующих эффектов разрыва мембраны внутриклеточных везикул. И в различных ситуациях есть побочные эффекты.
