소포가 세포 형성 과정으로 세포 내로 세포 내 사이 토시스가 형성됩니다. 소포의 투과화는 다양한 신호 경로를 활성화합니다. 발색단 보조 레이저 비활성화는 세포 내 소포 파열의 결과를 연구하는 데 사용됩니다.
세포내 소포에 대한 세포내 손상의 공간적 및 시간적 제어는 기립 조건 및 광 조명을 조정함으로써 달성될 수 있다. 시작하려면 10% FBS가 보충된 DMEM에서 HeLa 세포 배양을 유지합니다. 세포를 PBS로 세척한 후, 세포를 트립신화한다.
그런 다음 10% FBS가 보충된 DMEM의 셀을 다시 일시 중단합니다. 300 나노그램의 Gal3-GFP 플라스미드를 25 마이크로리터의 환원된 혈청 배지에 희석합니다. 그런 다음 0.6 마이크로 리터 P3000 시약을 추가합니다.
그리고 부드럽게 섞은 다음 용액을 와동시킵니다. 0.45 마이크로 리터의 리포 펙 타민 3000 시약을 25 마이크로 리터의 환원 혈청 배지에 희석하고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
그런 다음 희석된 DNA와 희석된 리포펙타민 3000을 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. DNA 리포펙타민 혼합물, 300, 000 현탁 HeLa 세포 및 200 마이크로리터의 DMEM을 10%FBS와 혼합한 후, 35 밀리미터 유리 버튼 접시의 중앙 유리 영역에 세포를 시딩한다. 세포 부착을 허용하려면 5% 이산화탄소가 공급되는 인큐베이터에서 섭씨 37도의 세포에서 최소 4시간 동안 배양합니다.
10% FBS가 보충된 DMEM에 AlPcS2a를 희석하여 1마이크로몰 AlPcS2a 용액을 만듭니다. 섭씨 37도의 수조에서 AlPcS2a 함유 배지를 예열하고 배양 배지를 AlPcS2a 함유 배지로 교체합니다. 하룻밤 동안 5% 이산화탄소가 공급되는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.
다음날, 세포를 PBS로 2회 세척하여 배지를 새로운 배지로 교체한 후 세포외 AlPcS2a를 제거하였다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양하여 세포내 경로를 따라 잔류 염료가 리소좀으로 축적되도록 합니다. 리소좀을 손상시켜 단세포를 조작하려면 배양 접시를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓습니다.
488 나노미터 및 561 나노미터 레이저를 사용하여 GFP 및 AlPcS2a를 각각 자극합니다. 손상된 것으로 선택된 AlPcS2a 표지 소포에 5 x 5 마이크로미터 정사각형 관심 영역에 동그라미를 칩니다. 그런 다음 펄스는 0.21 밀리 와트의 633 나노 미터 레이저 또는 70 회 반복으로 관심 영역을 비춥니다.
리소좀 막 투과화의 지표로서 Gal3 반점의 형성을 모니터링합니다. HeLa 세포에서 AlPcS2a를 이용한 리소좀 염색은 시판되는 마커를 사용하여 수행하였으며, 녹색 형광 염료로 양성 염색하였다. TagRFP-Galectin3 발현 HeLa 세포의 리소좀은 AlPcS2a로 염색되었습니다.
근적외선으로 조명을 집중시킨 결과, 결과는 AlPcS2a 기반 발색단 보조 레이저 비활성화가 관심 영역 내의 국소 리소좀 파열을 제어하여 나머지 리소좀을 그대로 유지할 수 있음을 나타냅니다. 이 단계는 배양 시간에 따라 스탠딩 엔도솜 또는 리소좀이 결정되기 때문에 중요합니다. 예를 들어, 사람들은 막 불투과성 염료의 방출에 의해 크기를 결정할 수 있습니다.
또한 FITC 덱스트란과 같은 pH에 민감한 염료를 사용하여 엔도솜과 리소좀을 구별할 수 있습니다. 이 기술은 세포 내 소포 막 파열의 다운스트림 효과를 시작하는 데 유용합니다. 그리고 다양한 상황에서 다운스트림 효과가 있습니다.
