A endocitose da vesícula em citoplasia resulta na formação de vesículas intracelulares. A permeabilização da vesícula ativa várias vias de sinal. A inativação do laser assistida por cromóforos é usada para estudar a consequência da ruptura da vesícula intracelular.
Um controle espacial e temporal do dano subcelular às vesículas intracelulares pode ser obtido ajustando a condição ortostática e a iluminação luminosa. Para começar, mantenha a cultura de células HeLa em DMEM suplementado com 10% FBS. Depois de lavar as células com PBS, Trypsinize as células.
Em seguida, ressuspenda as células em DMEM suplementado com 10% FBS. Diluir 300 nanogramas do plasmídeo Gal3-GFP em 25 microlitros de meio sérico reduzido. Em seguida, adicione 0,6 microlitros de reagente P3000.
E misture delicadamente, seguido de agitar a solução. Diluir 0,45 microlitros do reagente Lipofectamina 3000 em 25 microlitros de soro reduzido e misturar suavemente. Incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, misturar o DNA diluído e a Lipofectamina 3000 diluída e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Depois de misturar a mistura de DNA lipofectamina, 300.000 células HeLa suspensas e 200 microlitros de DMEM com 10% FBS, semeie as células na região central de vidro de uma placa de botão de vidro de 35 milímetros. Para permitir a fixação celular, incube as células a 37 graus Celsius na incubadora abastecida com 5% de dióxido de carbono por pelo menos quatro horas.
Diluir AlPcS2a em DMEM suplementado com 10% FBS para fazer uma solução de AlPcS2a micromolar. Pré-aqueça o meio contendo AlPcS2a em banho-maria de 37 graus Celsius e substitua o meio de cultura pelo meio contendo AlPcS2a. Incubar as células a 37 graus Celsius na incubadora abastecida com 5% de dióxido de carbono durante a noite.
No dia seguinte, lavar as células duas vezes com PBS para remover AlPcS2a extracelular após substituir o meio por meio fresco. Incubar a 37 graus Celsius durante quatro horas para permitir que o corante residual ao longo da via endocítica se acumule nos lisossomas. Para manipular células isoladas danificando lisossomos, coloque a placa de cultura no palco de um microscópio confocal.
Use os lasers de 488 nanômetros e 561 nanômetros para excitar GFP e AlPcS2a, respectivamente. Circule uma região quadrada de cinco por cinco micrômetros de interesse nas vesículas marcadas com AlPcS2a que são selecionadas para serem danificadas. Em seguida, o pulso ilumine a região de interesse com um laser de 633 nanômetros de 0,21 miliwatt, ou 70 repetições.
Monitorar a formação de pontos de Gal3 como um indicador de permeabilização da membrana lisossomal. A coloração lisossômica com AlPcS2a em células HeLa foi realizada usando marcadores disponíveis comercialmente, e foram coradas positivamente com corante verde fluorescente. Os lisossomos em células HeLa expressas por TagRFP-Galectin3 foram corados com AlPcS2a.
Seguido pela focalização da iluminação com luz infravermelha próxima, os resultados indicam que a inativação do laser assistida por cromóforos baseada em AlPcS2a foi capaz de controlar a ruptura lisossômica local dentro da região de interesse, deixando o restante dos lisossomos intactos. Essa etapa é importante, pois o tempo de incubação determinará os endossomos ou lisossomos em pé. Por exemplo, as pessoas podem determinar o tamanho de pela liberação de corante impermeável à membrana.
Também pode usar corantes sensíveis ao pH como FITC dextran para diferenciar endossomos e lisossomos. Esta técnica é útil a partir dos efeitos a jusante da ruptura da membrana da vesícula intracelular. E há efeitos a jusante em várias situações.
