La endocitosis de la vesícula en citoplasia da lugar a la formación de vesículas intracelulares. La permeabilización de la vesícula activa varias vías de señalización. La inactivación láser asistida por cromóforos se utiliza para estudiar las consecuencias de la ruptura de vesículas intracelulares.
Se puede lograr un control espacial y temporal del daño subcelular a las vesículas intracelulares ajustando la condición de pie y la iluminación de la luz. Para comenzar, mantenga el cultivo celular HeLa en DMEM suplementado con 10% FBS. Después de lavar las células con PBS, tripsinizar las células.
Luego resuspender las células en DMEM suplementado con 10% FBS. Diluir 300 nanogramos de plásmido Gal3-GFP en 25 microlitros de medio sérico reducido. Luego agregue 0.6 microlitros de reactivo P3000.
Y mezclar suavemente, seguido de vórtice de la solución. Diluir 0,45 microlitros del reactivo Lipofectamine 3000 en 25 microlitros de medio sérico reducido y mezclar suavemente. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Luego mezcle el ADN diluido y la lipofectamina diluida 3000 e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de mezclar la mezcla de ADN lipofectamina, 300, 000 células HeLa suspendidas y 200 microlitros de DMEM con 10% FBS, siembran las células en la región central de vidrio de un plato de botón de vidrio de 35 milímetros. Para permitir la unión celular, incube las células a 37 grados centígrados en la incubadora suministrada con 5% de dióxido de carbono durante al menos cuatro horas.
Diluir AlPcS2a en DMEM suplementado con 10% FBS para hacer una solución micromolar de AlPcS2a. Precaliente el medio que contiene AlPcS2a en un baño de agua de 37 grados centígrados y reemplace el medio de cultivo con el medio que contiene AlPcS2a. Incubar las células a 37 grados centígrados en la incubadora suministrada con 5% de dióxido de carbono durante la noche.
Al día siguiente, lave las células dos veces con PBS para eliminar AlPcS2a extracelular después de reemplazar el medio con medio fresco. Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas para permitir que el tinte residual a lo largo de la vía endocítica se acumule en los lisosomas. Para manipular células individuales dañando los lisosomas, coloque la placa de cultivo en el escenario de un microscopio confocal.
Utilice los láseres de 488 nanómetros y 561 nanómetros para excitar GFP y AlPcS2a, respectivamente. Encierre en un círculo una región cuadrada de cinco por cinco micrómetros de interés en las vesículas marcadas con AlPcS2a que se seleccionan para ser dañadas. Luego iluminar el pulso de la región de interés con un láser de 633 nanómetros de 0,21 milivatios, o 70 repeticiones.
Monitorizar la formación de Gal3 puncta como indicador de permeabilización de la membrana lisosomal. La tinción lisosomal con AlPcS2a en células HeLa se realizó utilizando marcadores disponibles comercialmente, y se tiñeron positivamente con colorante fluorescente verde. Los lisosomas en TagRFP-Galectin3 expresaron células HeLa se tiñeron con AlPcS2a.
Seguido de enfocar la iluminación con luz infrarroja cercana, los resultados indican que la inactivación por láser asistida por cromóforos basada en AlPcS2a fue capaz de controlar la ruptura lisosomal local dentro de la región de interés, dejando intactos el resto de los lisosomas. Este paso es importante porque el tiempo de incubación determinará los endosomas o lisosomas de pie. Por ejemplo, las personas pueden determinar el tamaño de por la liberación de tinte impermeable a la membrana.
También puede utilizar colorantes sensibles al pH como el dextrano FITC para diferenciar endosomas y lisosomas. Esta técnica es útil para iniciar los efectos posteriores de la ruptura de la membrana de la vesícula intracelular. Y hay efectos posteriores en diversas situaciones.
