该方法可以快速生成高分辨率图像，允许分析细胞内荧光信号的空间分布和定量，同时允许快速分析多个样品。使用先进的成像流式细胞术系统测量细胞，将速度、灵敏度和详细的单细胞图像与空间信息相结合，产生流式视光学或显微镜无法提供的独特数据。一个重要的建议是提供足够的电池来建立仪器设置，我们将细胞以高密度悬浮以进行测量。
除此之外，数据采集非常简单，类似于传统的流式细胞术。首先生成手稿中描述的DLBCL细胞系。然后将10毫摩尔EdU溶液以1：1000的比例加入DLBCL细胞培养物中，并将板在37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中孵育3小时，然后通过轻轻摇动混合板。
孵育后取出板，加入100毫摩尔氯喹溶液至终浓度为75微摩尔。轻轻摇动混合并孵育 30 分钟。然后加入20毫摩尔C12 FDG溶液至终浓度为20微摩尔。
轻轻混合后，如前所述将板孵育一小时。接下来，以 1 至 50 的比例加入 100 毫摩尔 2-苯乙基-β-d-硫代半乳糖苷溶液以停止 FSA β-半乳糖染色。并轻轻旋转盘子进行混合。
将细胞转移到15毫升无菌离心管中，并在4摄氏度下以100倍G旋转5分钟。丢弃上清液后，用四毫升PBS洗涤细胞，并在4摄氏度下以100倍G离心5分钟。然后将细胞沉淀在4%多聚甲醛固定溶液中的500微升中重新悬浮。
在室温下孵育10分钟后，在室温下以250倍G离心5分钟。弃去上清液，用四毫升PBS洗涤细胞两次，并在室温下以100倍G离心5分钟。洗涤后，弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在200微升皂苷透化缓冲液中。
现在将悬浮液转移到新的1.5毫升管中，并在室温下孵育10分钟。在室温下以250倍G沉淀细胞五分钟。然后将细胞重新悬浮在200微升一抗溶液中，并在黑暗中以4摄氏度孵育过夜。
在 250 倍 G 下以 4 摄氏度离心管五分钟。弃去上清液，用100微升皂苷洗涤液洗涤。洗涤细胞两次后，弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在500微升EdU检测混合物中。
在室温下在黑暗中孵育30分钟，并在室温下以250倍G离心5分钟。弃去上清液，用一毫升皂苷洗涤液洗涤。重复洗涤两次，弃去上清液并将细胞沉淀重新悬浮在20至50微升PBS中。
在打开仪器之前，清空废液瓶并检查速珠、灭菌器、清洁器、除泡器和护套的液位是否充足。打开仪器和成像软件后，单击启动按钮以初始化流体和系统校准。将放大倍率设置为 40 倍，并将流体速度设置为低。
打开激光器后，打开405纳米激光测量EdU Pacific Blue，488纳米测量C12-FDG，642纳米测量Alexa-Fluor-647-γ-H2AX。为散射通道设置通道六，为明场设置通道 1 和通道 9。然后从预期具有最高荧光的样品开始，以设置激光的强度，并轻轻翻转样品管进行混合。
打开试管盖后，将样品管插入底座上。单击加载以开始并打开散点图。接下来，选择 特征 区域，下划线 MO1 和纵横比下划线 MO1 分别用于 X 轴和 Y 轴。
将上方的门设置为0.5，以排除下方和右侧的双峰和细胞聚集体以及左侧的SpeedBead群。现在，打开直方图并为X轴选择掩码1和通道1的特征梯度均方根。选择单重态群体并设置门以选择聚焦细胞。
打开直方图并为 X 轴通道 2、7 和 11 选择原始最大像素强度。然后分别调整通道二、七和 11 的 488 纳米、405 纳米和 642 纳米激光器的激光功率，使每个荧光染料的原始最大像素值在 100 到 4， 000 之间，以避免过饱和。选择要记录的重点人群，然后单击“获取”以一致的设置测量DLBCL样本。
更换样品进行测量时，单击返回以恢复样品管。按加载以丢弃样本。测量完所有样品后，关闭明场并散射激光。
测量单色对照样品以生成补偿矩阵。单击关机关闭成像系统。在图像分析软件中分析数据。
使用图像分析软件的点向导工具自动计数和量化核伽马 H2AX 病灶和活细胞图像。选择两个细胞群，一个具有高斑点计数，一个具有低斑点计数，以训练斑点向导以进行进一步的自动斑点计数分析。单细胞图像中的流式细胞术方法显示C12-FDG阳性，EdU阴性，γH2AX阳性，衰老群体和KARPAS422增加。
WSU-DLCL2和OCI-LY1细胞，但不在SU-DHL6细胞中。基于成像的分析显示γ H2AX病灶和KARPAS422，WSU-DLCL2和OCI-LY1的数量显着增加，但在SU-DHL6细胞中则不然。频率和定量数据表示了类似的结果。
在细胞悬液中添加皂苷至关重要，否则抗体无法到达细胞内部抗原，刺激性去垢剂会导致C12-FTG信号丢失 成像细胞术是分析标志物定位变化的最佳选择，例如转录因子对某些刺激的易位到细胞核。这样的分析也可以通过我们的协议来实现。该方法允许在单细胞水平上可视化多个荧光标记物，这有助于检测单个信号的存在、强度和定位。
