Este método pode gerar rapidamente imagens de alta resolução que permitem uma análise da distribuição espacial e quantificação de sinais fluorescentes dentro das células, permitindo a análise rápida de múltiplas amostras. As células são medidas usando o sistema avançado de citometria de fluxo de imagem, combinando velocidade, sensibilidade e imagens de célula única detalhada com informações espaciais que produzem dados únicos que não podem ser fornecidos por optometria ou microscopia de fluxos. Um conselho importante é fornecer células suficientes para estabelecer as configurações do instrumento e suspendemos as células na alta densidade para as medições.
Além dessa aquisição de dados é simples e semelhante à citometria de fluxo convencional. Primeiro gerar as linhas celulares DLBCL como descrito no manuscrito. Em seguida, adicione 10 milimões de solução EdU a uma proporção de um a 1000 na cultura celular DLBCL e incubar a placa em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% a 37 graus Celsius por três horas depois de misturar a placa por balanço suave.
Tire a placa após a incubação e adicione 100 milimonas de solução de cloroquina a uma concentração final de 75 micromolar. Misture balançando suavemente e incubar por 30 minutos. Em seguida, adicione 20 milimões C12 FDG soluções a uma concentração final de 20 micromolar.
Após uma mistura suave, incubar a placa por uma hora como demonstrado anteriormente. Em seguida, adicione 100 milimilmolar 2-fenilethyl-beta-d-thiogalactoside solução em um a 50 para parar a mancha beta-gal FSA. E gire suavemente a placa para misturar.
Transfira as células para tubos de centrífuga estéril de 15 mililitros e gire a 100 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Uma vez que o supernante é descartado, lave as células com quatro mililitros de PBS e centrífuga a 100 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, suspenda novamente as pelotas celulares em 500 microliters a 4% de solução de fixação de paraformaldeído.
Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrífuga a 250 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e lave as células com quatro mililitros de PBS duas vezes e centrífuga a 100 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Após a lavagem, descarte o supernascer e suspenda a pelota celular em 200 microliters de tampão de permeabilização de saponina.
Agora transfira a suspensão para um novo tubo de 1,5 mililitro e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. Pelota as células a 250 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, suspenda novamente as células em 200 microlitres da solução primária de anticorpos e incubam a quatro graus Celsius durante a noite, no escuro.
Centrifugar os tubos a 250 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e lave com 100 microliters de solução de lavagem de saponina. Depois de lavar as células duas vezes, descarte o sobrenante e suspenda as pelotas celulares em 500 microliters de coquetel de detecção de EdU.
Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro e centrífuga a 250 vezes G durante cinco minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e lave com um mililitro de solução de lavagem de saponina. Repita a lavagem duas vezes, descarte o supernascer e suspenda as pelotas celulares em 20 a 50 microliters de PBS.
Antes de ligar o instrumento, esvazie a garrafa de fluido de resíduo e verifique os níveis de SpeedBeads, esterilizador, limpador, depurador e bainha suficientes. Depois de ligar o instrumento e o software de imagem, clique no botão de inicialização para inicializar fluidez e calibração do sistema. Defina a ampliação para 40 vezes e coloque a velocidade fluida em baixa.
Depois de ligar os lasers, ligue um laser de 405 nanômetros para medir EdU Pacific Blue, 488 nanômetros para medir C12-FDG e 642 nanômetros para medir Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Defina o canal seis para o canal de dispersão, canal um e canal nove para o campo brilhante. Em seguida, comece com a amostra esperada para ter a maior fluorescência para configurar a intensidade dos lasers e gentilmente virar o tubo de amostra para misturar.
Depois de abrir a tampa do tubo, insira o tubo de amostra na doca. Clique em Carregar para iniciar e abrir um gráfico de dispersão. Em seguida, selecione a área características, enfatize MO1 e a proporção enfatize MO1 para os eixos X e Y, respectivamente.
Defina um portão acima da proporção de 0,5 para excluir doublets e agregados celulares abaixo e no lado direito e na população speedBead no lado esquerdo. Agora, abra o Plot histograma e selecione o quadrado médio de gradiente da máscara um e o canal um para o eixo X. Escolha a população singlet e defina o portão para selecionar para células focadas.
Abra um gráfico de histograma e selecione intensidades de pixel máximos brutas para o eixo X canal dois, sete e 11. Em seguida, ajuste os poderes laser de 488 nanômetros, 405 nanômetros e 642 nanômetros lasers para o canal dois, sete e 11, respectivamente, para que cada fluorocromo tenha um valor máximo bruto de pixel entre 100 e 4.000 para evitar a supersaturação. Escolha a população focada para gravar e clicar em Adquirir para medir as amostras de DLBCL com configurações consistentes.
Ao alterar amostras para medição, clique em retornar para recuperar o tubo de amostra. Pressione a carga para descartar a amostra. Depois que todas as amostras forem medidas, desligue o campo brilhante e espalhe o laser.
Meça amostras de controle de cor única para gerar uma matriz de compensação. Clique em Shutdown para fechar o sistema de imagem. Analise os dados no software de análise de imagens.
Use a ferramenta Spot Wizard do software de análise de imagens para contar e quantificar automaticamente os focos nucleares gama H2AX e imagens de células ao vivo. Selecione duas populações de células, uma com alta e outra com baixa contagem de pontos para treinar o Assistente spot para uma análise adicional automática da contagem de pontos. O método de citometria de fluxo em imagens unicelulares mostrou aumento do C12-FDG positivo, EdU negativo, gama H2AX positivo, população senesced e KARPAS422.
Células WSU-DLCL2 e OCI-LY1, mas não em células SU-DHL6. A análise baseada em imagens apresentou números significativamente maiores de focos gama H2AX e KARPAS422, WSU-DLCL2 e OCI-LY1, mas não em células SU-DHL6. Resultados semelhantes foram representados por dados de frequência e quantificação.
Adicionar saponina à suspensão celular é crucial, caso contrário, os anticorpos não podem atingir os antígenos internos da célula e detergentes severos levam à perda de sinal C12-FTG A citometria de imagem é ideal para analisar mudanças na localização do marcador, como a translocação de um fator de transcrição para o núcleo em resposta a certos estímulos. Tal análise também pode ser alcançada com nosso protocolo. Este método permite visualizar múltiplos marcadores fluorescentes em um nível unicelular que ajuda a detectar a presença, intensidade e localização dos sinais individuais.
