この手法は、細胞内の蛍光シグナルの空間分布の解析と定量を可能にする高解像度の画像を迅速に生成し、複数のサンプルの迅速な解析を可能にします。細胞は、高度なイメージングフローサイトメトリーシステムを使用して測定され、速度、感度、詳細な単一細胞画像と空間情報を組み合わせることで、フロー検眼や顕微鏡では提供できない独自のデータが得られます。重要なアドバイスの1つは、機器の設定を確立するのに十分なセルを提供し、測定のためにセルを高密度で吊り下げることです。
このデータ取得を除けば、従来のフローサイトメトリーと同様に簡単です。まず、原稿に記載されているようにDLBCL細胞株を生成します。次に、10ミリモルのEdU溶液を1対1000の比率でDLBCL細胞培養液に加え、プレートを穏やかに揺動させて混合した後、摂氏37度の5%二酸化炭素インキュベーターでプレートを3時間インキュベートします。
インキュベーション後にプレートを取り出し、100ミリモルのクロロキン溶液を最終濃度75マイクロモルまで加えます。穏やかに揺り動かして混合し、30分間インキュベートします。次に、20ミリモルのC12 FDG溶液を最終濃度20マイクロモルまで加えます。
穏やかに混合した後、前に示したようにプレートを1時間インキュベートします。次に、100ミリモルの2−フェニルエチル−β−d−チオガラクトシド溶液を1〜50で添加し、FSAベータ−gal染色を停止した。そして、プレートをゆっくりと回転させて混ぜます。
細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブに移し、摂氏4度で5分間100倍Gで回転させます。上清が廃棄されたら、細胞を4ミリリットルのPBSで洗浄し、摂氏4度で5分間100倍Gで遠心分離します。次いで、細胞ペレットを4%パラホルムアルデヒド固定溶液中の500マイクロリットルに再懸濁する。
室温で10分間インキュベートした後、室温で5分間250倍Gで遠心分離する。上清を捨て、細胞を4ミリリットルのPBSで2回洗浄し、室温で5分間100倍Gで遠心分離します。洗浄後、上清を捨て、細胞ペレットを200マイクロリットルのサポニン透過処理バッファーに再懸濁する。
懸濁液を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、室温で10分間インキュベートします。細胞を250倍Gで室温で5分間ペレット化する。その後、細胞を200マイクロリットルの一次抗体溶液に再懸濁し、暗所で摂氏4度で一晩インキュベートします。
チューブを摂氏4度で5分間、250倍Gで遠心分離します。上清を捨て、100マイクロリットルのサポニン洗浄液で洗浄する。細胞を2回洗浄した後、上清を捨て、細胞ペレットを500マイクロリットルのEdU検出カクテルに再懸濁します。
室温で暗所で30分間インキュベートし、室温で5分間250倍Gで遠心分離します。上清を捨て、1ミリリットルのサポニン洗浄液で洗浄する。洗浄を2回繰り返し、上清を捨て、細胞ペレットを20〜50マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
機器の電源を入れる前に、廃液ボトルを空にし、SpeedBeeds、滅菌器、クリーナー、デバブラー、シース液のレベルを確認してください。機器とイメージングソフトウェアの電源を入れた後、起動ボタンをクリックして、流体工学とシステムキャリブレーションを初期化します。倍率を40倍に設定し、流体速度を低に設定します。
レーザーのスイッチを入れた後、405ナノメートルのレーザーをオンにしてEdUパシフィックブルーを測定し、488ナノメートルでC12-FDGを測定し、642ナノメートルをオンにしてAlexa-Fluor-647-γ-H2AXを測定します。散乱チャンネルにはチャンネル6、明視野にはチャンネル1、チャンネル9を設定します。次に、最も高い蛍光が予想されるサンプルから始めてレーザーの強度を設定し、サンプルチューブを静かに反転させて混合します。
チューブの蓋を開けた後、サンプルチューブをドックに挿入します。[読み込み]をクリックして散布図を開始し、開きます。次に、[機能]領域を選択し、X軸とY軸にそれぞれMO1とアスペクト比の下線MO1を引きます。
アスペクト比より上のゲートを 0.5 に設定して、その下と右側のダブレットと細胞凝集体を除外し、左側の SpeedBead 集団を除外します。次に、ヒストグラムプロットを開き、X軸のマスク1とチャンネル1の特徴勾配根平均平方根を選択します。一重項母集団を選択し、フォーカスされたセルを選択するようにゲートを設定します。
ヒストグラムプロットを開き、X軸チャンネル2、7、および11の生の最大ピクセル強度を選択します。次に、チャンネル2、7、11のレーザー488ナノメートル、405ナノメートル、642ナノメートルのレーザーパワーを調整して、過飽和を避けるために各蛍光色素の生の最大ピクセル値が100〜4, 000になるようにします。記録する焦点を絞った母集団を選択し、取得をクリックして、一貫した設定でDLBCLサンプルを測定します。
測定のためにサンプルを交換するときは、戻るをクリックしてサンプルチューブを回収します。ロードを押してサンプルを破棄します。すべてのサンプルが測定されたら、明視野と散乱レーザーをオフにします。
単一のカラーコントロールサンプルを測定して、補正マトリックスを生成します。シャットダウンをクリックして、イメージングシステムを閉じます。画像解析ソフトウェアでデータを解析します。
画像解析ソフトウェアのスポットウィザードツールを使用して、核ガンマH2AX病巣と生細胞画像を自動的にカウントおよび定量化します。スポット数が多い細胞と少ない細胞の2つの細胞集団を選択して、スポットウィザードをトレーニングして、さらに自動スポットカウント分析を行います。シングルセル画像におけるフローサイトメトリー法は、C12-FDG陽性、EdU陰性、γH2AX陽性、老化集団およびKARPAS422の増加を示した。
WSU-DLCL2 および OCI-LY1 細胞であるが、SU-DHL6 細胞には存在しない。イメージングベースの解析では、ガンマH2AX病巣とKARPAS422、WSU-DLCL2、OCI-LY1の数が有意に多かったが、SU-DHL6細胞では見られなかった。同様の結果は、頻度および定量化データによって表された。
細胞懸濁液にサポニンを添加することは極めて重要であり、そうでなければ抗体は細胞内部抗原に到達できず、界面活性剤はC12-FTGシグナルの喪失につながる イメージングサイトメトリーは、特定の刺激に応答して転写因子の核への転座など、マーカー局在の変化を分析するのに最適です。このような分析は、私たちのプロトコルでも達成できます。この方法では、単一細胞レベルで複数の蛍光マーカーを可視化することができ、個々のシグナルの存在、強度、局在を検出するのに役立ちます。
