이 방법은 고해상도 이미지를 신속하게 생성하여 세포 내 형광 신호의 공간 분포 및 정량화를 분석하는 동시에 여러 샘플을 신속하게 분석할 수 있습니다. 세포는 고급 이미징 유세포 분석 시스템을 사용하여 측정되며, 속도, 감도 및 상세한 단일 세포 이미지를 공간 정보와 결합하여 흐름 검안 또는 현미경으로는 제공할 수 없는 고유한 데이터를 생성합니다. 한 가지 중요한 조언은 기기 설정을 설정하기에 충분한 셀을 제공하고 측정을 위해 셀을 고밀도로 현탁하는 것입니다.
이 외에도 데이터 수집은 간단하고 기존의 유세포 분석과 유사합니다. 먼저 원고에 기재된 대로 DLBCL 세포주를 생성한다. 그런 다음 DLBCL 세포 배양액에 1에서 1000의 비율로 10 밀리몰 EdU 용액을 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합 한 후 섭씨 37 도의 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
배양 후 플레이트를 꺼내고 최종 농도 75 마이크로 몰이 되도록 클로로퀸 용액 100밀리몰을 추가합니다. 부드럽게 흔들어 혼합하고 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 20 밀리몰 C12 FDG 용액을 최종 농도 20 마이크로 몰에 첨가하십시오.
부드럽게 혼합한 후, 이전에 설명된 대로 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 100 밀리몰 2-페닐에틸-베타-d-티오갈락토시드 용액을 1 내지 50에 첨가하여 FSA 베타-갈 염색을 중지시킨다. 그리고 플레이트를 부드럽게 돌려 혼합합니다.
세포를 15 밀리리터 멸균 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 5 분 동안 100 회 G로 회전시킵니다. 상청액이 버려지면 세포를 4 밀리리터의 PBS로 세척하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 100 배 G로 원심 분리합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드 고정 용액에서 500마이크로리터에 세포 펠릿을 다시 현탁합니다.
실온에서 10분간 배양한 후, 실온에서 5분 동안 250회 G로 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포를 PBS 4 밀리리터로 2회 세척하고 실온에서 5분 동안 G 100배로 원심분리한다. 세척 후, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 200 마이크로리터의 사포닌 투과화 완충액에 재현탁시킨다.
이제 현탁액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 세포를 실온에서 5분 동안 250배 G로 펠렛화한다. 그런 다음 세포를 200 마이크로리터의 1차 항체 용액에 재현탁시키고 암실에서 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다.
튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 100 마이크로리터의 사포닌 세척액으로 세척한다. 세포를 2회 세척한 후, 상청액을 버리고 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 EdU 검출 칵테일에 재현탁시킨다.
어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 배양하고 실온에서 5분 동안 250배 G에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1 밀리리터의 사포닌 세척 용액으로 세척하십시오. 세척을 2회 반복하고, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 20 내지 50 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.
기기를 켜기 전에 폐액 병을 비우고 SpeedBeads, 살균기, 클리너, 디버블러 및 피복 충분한 유체의 수준을 확인하십시오. 기기 및 이미징 소프트웨어를 켠 후 시작 버튼을 클릭하여 유체 공학 및 시스템 교정을 초기화합니다. 배율을 40배로 설정하고 유체 속도를 낮음으로 설정합니다.
레이저를 켠 후 405나노미터 레이저를 켜서 EdU Pacific Blue를 측정하고 488나노미터를 켜서 C12-FDG를 측정하고 642나노미터를 켜서 Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX를 측정합니다. 산란 채널에 채널 6, 명시야에 채널 1, 채널 9를 설정합니다. 그런 다음 형광이 가장 높을 것으로 예상되는 샘플로 시작하여 레이저의 강도를 설정하고 샘플 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
튜브 뚜껑을 연 후 샘플 튜브를 도크에 삽입합니다. 로드를 클릭하여 산점도를 시작하고 엽니다. 그런 다음 기능 영역을 선택하고 X 및 Y 축에 대해 MO1 및 종횡비 밑줄 MO1을 각각 선택합니다.
게이트의 가로 세로 비율을 0.5로 설정하여 아래와 오른쪽의 더블릿과 셀 응집체와 왼쪽의 SpeedBead 모집단을 제외합니다. 이제 히스토그램 플롯을 열고 마스크 1의 특징 기울기 평균 제곱근을 선택하고 X축에 대해 채널 1을 선택합니다. 단일항 모집단을 선택하고 집중된 셀을 선택할 게이트를 설정합니다.
히스토그램 플롯을 열고 X축 채널 2, 7, 11에 대한 원시 최대 픽셀 강도를 선택합니다. 그런 다음 채널 2, 7 및 11에 대해 각각 488 나노 미터, 405 나노 미터 및 642 나노 미터 레이저의 레이저 출력을 조정하여 각 형광 색소가 과포화를 피하기 위해 100에서 4, 000 사이의 원시 최대 픽셀 값을 갖도록합니다. 기록할 포커스 모집단을 선택하고 획득을 클릭하여 일관된 설정으로 DLBCL 샘플을 측정합니다.
측정을 위해 샘플을 변경할 때 리턴을 클릭하여 샘플 튜브를 복구합니다. 로드를 눌러 샘플을 삭제합니다. 모든 샘플을 측정 한 후 명시야를 끄고 레이저를 산란시킵니다.
단색 대조 샘플을 측정하여 보정 매트릭스를 생성합니다. 종료를 클릭하여 이미징 시스템을 닫습니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 데이터를 분석합니다.
이미지 분석 소프트웨어의 스팟 마법사 도구를 사용하여 핵 감마 H2AX 초점 및 라이브 셀 이미지를 자동으로 계수하고 정량화할 수 있습니다. 두 개의 셀 모집단(하나는 높은 셀 개체군과 다른 하나는 낮은 스팟 카운트)을 선택하여 추가 자동 스팟 카운트 분석을 위해 스팟 마법사를 훈련시킵니다. 단일 세포 이미지에서 유세포 분석 방법은 C12-FDG 양성, EdU 음성, 감마 H2AX 양성, 노화 된 인구 및 KARPAS422가 증가한 것으로 나타났습니다.
WSU-DLCL2 및 OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포가 아닙니다. 이미징 기반 분석은 상당히 많은 수의 감마 H2AX 초점 및 KARPAS422, WSU-DLCL2 및 OCI-LY1을 나타냈지만 SU-DHL6 세포에서는 그렇지 않았습니다. 유사한 결과가 빈도 및 정량화 데이터로 표시되었습니다.
세포 현탁액에 사포닌을 추가하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 항체가 세포 내부 항원에 도달할 수 없으며 강한 세제로 인해 C12-FTG 신호가 손실됩니다. 이미징 세포분석은 특정 자극에 대한 반응으로 전사 인자를 핵으로 전좌하는 것과 같은 마커 국소화의 변화를 분석하는 데 최적입니다. 이러한 분석은 당사 프로토콜로도 달성할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 단일 세포 수준에서 여러 형광 마커를 시각화하여 개별 신호의 존재, 강도 및 위치를 감지할 수 있습니다.
